牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶的研究进展

    牙周炎是一种发生在牙齿支持组织的慢性非特异性炎症，能引起牙龈、牙周膜的破坏及牙槽骨的吸收，最终可导致牙齿松动脱落。其主要感染原为堆积在牙颈部及龈沟内的牙菌斑微生物，其中革兰阴性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）为牙周炎最密切相关的致病菌之一，其代谢产生牙龈蛋白酶（gingipains）、脂多糖、肽聚糖和鞭毛蛋白等相关毒力因子。
    牙龈蛋白酶是在细胞质中合成并通过转运分泌至细胞外的蛋白水解酶，由于其提供了P.gingivalis约85%的蛋白水解活性，因此已被认为是重要的毒力因子。因此，抑制其表达及毒力作用有望成为牙周炎治疗的新策略。本文就P.gingivalis牙龈蛋白酶的分类、分泌、致病作用及其抑制剂的研究现状进行综述。
    1.牙龈蛋白酶的分类及其分泌
    1.1 牙龈蛋白酶的分类
    牙龈蛋白酶是P.gingivalis特有的细胞外蛋白酶，包括精氨酸特异性蛋白酶（Arggingipains或gingipain R，Rgps）和赖氨酸特异性蛋白酶（Lys-gingipain或gingipain K，Kgp），分别特异性地识别和水解蛋白的精氨酸和赖氨酸位点。牙龈蛋白酶由3个独立基因rgpA、rgpB和kgp编码而成，其中kgp和rgpA编码的多蛋白（Kgp和RgpA）包含信号肽、前肽、蛋白酶、粘附域和C末端域（CTD），rgpB编码的蛋白质（RgpB）包含信号肽、前肽和蛋白酶结构域以及CTD。
    1.2 牙龈蛋白酶的分泌
    Kgp和Rgps首先在细胞质中合成，具有典型的N端信号肽，可通过Sec系统跨内膜转运。在这一步，信号肽被信号肽酶Ⅰ去除，新暴露的N端的谷氨酰胺被位于内膜周质表面的谷氨酰胺环化酶环化为焦谷氨酸。在周质中，牙龈蛋白酶通过它们的CTD定向到Ⅸ型分泌系统（T9SS），通过T9SS跨外膜转运，在转运的过程中通过细胞表面附近的3C端信号肽酶PorU去除CTD，然后新形成的羰基与A-LPS通过异肽键共价连接，随后，外膜锚定的RgpB通过裂解NTP来激活自身，结束加工，但RgpA和Kgp的活化和进一步加工仍未研究透彻。
    有研究发现T9SS及其所有鉴定出的成分在P.gingivalis牙龈蛋白酶引起的感染中起着重要的作用，T9SS所鉴定出的任何成分的缺乏都会影响牙龈蛋白酶的分泌。但尽管T9SS的主要成分已经明确，与其相关的特征性蛋白质列表仍在不断增加。
    P.gingivalis ATCC 33277 基因PGN_0300编码的Omp17被标注为一种T9SS相关的膜蛋白，实验显示在PGN_0300基因缺陷菌株的任何膜部分均没有发现用来切割含CTD蛋白CTD部分的PorU，且该基因缺陷菌株牙龈蛋白酶的蛋白水解活性降低。而与PGN_0300同一个操纵子上的基因PGN_0297被预测编码一种定位于P.gingivalis细胞外膜的β-桶蛋白，与T9SS成分中的PorK和PorN相互作用，研究显示PGN_0297基因缺陷菌株的牙龈蛋白酶活性也降低。
最近的一项研究显示在P.gingivalis表达的一种缺乏同源传感器激酶的孤儿反应调节因子Rpry缺乏的情况下，牙龈蛋白酶的基因表达在mRNA水平下调，使P.gingivalis的毒力作用减弱。而更多影响牙龈蛋白酶分泌和成熟的因素仍有待于学者们进一步研究发现。
    2.牙龈蛋白酶的致病作用
    2.1 牙龈蛋白酶对宿主口腔组织的影响
    2.1.1 牙龈蛋白酶对组织破坏和再生的影响
    已有大量文献证明，牙龈蛋白酶可导致不同类型的细胞死亡，包括内皮细胞、人牙龈成纤维细胞、人牙龈上皮细胞以及成骨细胞。龈沟上皮为鳞状上皮，牙龈上皮细胞表达连接粘附分子JAM1，参与调节上皮屏障功能，牙龈蛋白酶可以特异性地降解质膜上成熟的JAM1，导致牙龈上皮对40kDa葡聚糖、脂多糖和蛋白聚糖具有了渗透性，从而丧失了鳞状上皮的屏障功能，使细菌致病因子得以渗透到上皮下组织，引起组织损伤。
    牙龈蛋白酶能通过对不同细胞产生不同影响导致牙周骨质丧失。它们既能通过引起细胞凋亡导致成骨细胞的功能受损，又能促进破骨细胞前体细胞的增殖，促进RANKL诱导的成熟破骨细胞的分化并增强破骨细胞的功能，成骨细胞功能受损，破骨细胞功能增强，骨吸收大于骨生成，骨再生受到抑制。牙龈蛋白酶还可能会显著影响P.gingivalis抑制口腔上皮细胞在损伤上皮层中迁移的能力，并可以诱导牙周的上皮细胞和成纤维细胞使其表型转变为胶原降解表型，从而不利于组织再生。
    2.1.2 牙龈蛋白酶对宿主免疫防御的影响
    牙龈蛋白酶依赖其蛋白水解作用破坏和逃避宿主的免疫系统，通过参与宿主基质金属蛋白酶的激活，降解包括免疫调节蛋白、信号通路调节蛋白和粘附分子、细胞因子、补体因子等在内的多种宿主蛋白，参与调节免疫反应和各种细胞中免疫介质的产生从而引起免疫反应失调和炎症。
    P.gingivalis 能够依赖牙龈蛋白酶并通过PAR-2、PLC、p38和NF-κB信号通路介导的方式上调人牙龈或口腔上皮细胞IL-33的表达，还能通过激活JNK和NF-κB信号通路，增加野生型小鼠牙龈组织中IL-31的表达。此外，有报道证明P.gingivalis可以诱导THP-1巨噬细胞释放尿酸，且其诱导的尿酸可以介导牙周组织细胞的炎症，而牙龈蛋白酶可以通过增加黄嘌呤氧化还原酶的表达和活性在THP-1巨噬细胞尿酸的产生中起重要作用。
    Toll样受体（TLR）参与检测PAMPs和细胞对细菌入侵的反应，CD14是几个TLR 识别细菌分子的共同受体。P.gingivalis可依赖于牙龈蛋白酶降低小鼠巨噬细胞CD14的表面表达。同时CD14也是凋亡细胞的关键巨噬细胞受体，牙龈蛋白酶可以降低凋亡细胞表面CD14的表达水平，导致凋亡细胞清除不良。
    2.2 牙龈蛋白酶对宿主其他组织的影响
    越来越多的证据表明P.gingivalis 与心血管疾病、阿尔茨海默病（AD）、糖尿病等全身性疾病的发生发展密切相关。近年来，体外研究表明，在循环血液移位的过程中，P.gingivalis将血管中的LDL/VLDL和HDL修饰为致动脉粥样硬化的形式，其中牙龈蛋白酶对脂蛋白的调节起到了至关重要的作用。此外，P.gingivalis还能通过牙龈蛋白酶降解血小板内皮细胞粘附分子-1和血管内皮钙粘蛋白，导致血管损伤和内皮通透性增加，导致内皮功能障碍。
    继动物实验发现P.gingivalis可以通过牙龈蛋白酶介导的PAR2的活化促进被感染小胶质细胞的细胞迁移和炎症反应后，Nonaka等就人小胶质细胞进行了体外实验并发现牙龈蛋白酶可以诱导PAR2内化，激活ERK1/2通路，促进人小胶质细胞迁移，表明P.gingivalis分泌的牙龈蛋白酶可以吸引小胶质细胞进入感染部位，导致AD患者过度的炎症和免疫反应。而最新的一项研究证明P.gingivalis可以侵入神经元并在其中存活，并且分泌牙龈蛋白酶，导致与AD相关的神经元损伤。
    包括P.gingivalis在内的革兰氏阴性细菌能产生外膜囊泡（OMVs）纳米颗粒，并将其释放到细胞外环境中。P.gingivalis释放的OMVs含有牙龈蛋白酶，并可将其转移到小鼠肝脏中，还能以依赖牙龈蛋白酶的方式减弱肝HepG2细胞中胰岛素诱导的Akt/糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）信号，引起肝脏葡萄糖代谢的改变，从而促进糖尿病的进展。
    3.牙龈蛋白酶的抑制剂
    局部应用药物治疗的方法在牙周病的治疗中已被广泛应用，这些药物包括洗必泰片、龈下强力霉素、米诺环素等，而在局部应用的治疗药物中添加牙龈蛋白酶抑制剂很可能会改善牙周病的局部治疗效果。
    血管通透性增强是牙周病主要的发病机制之一，是由牙周炎部位的牙龈蛋白酶通过激活激肽释放酶/激肽途径引起的。而一种戊烯基黄酮类化合物epimedokoreanin B，可阻断牙周组织中由P.gingivalis牙龈蛋白酶引起的止血障碍，抑制P.gingivalis培养上清降解血清蛋白和增强血管通透性的作用，保护牙周组织基质免受牙龈蛋白酶的破坏。
    最近，夹竹桃科的一种植物Solenostemma argel的叶子中分离出的一种孕烷糖苷类化合物Argeloside I被发现能完全抑制最具攻击性的P.gingivalis菌株TDC60的生长，并能抑制其牙龈蛋白酶的产生，表明epimedokoreanin B 和Argeloside I有可能作为新的药物来对抗牙周病原体。
    4.结语
    作为P.gingivalis最重要的毒力因子，牙龈蛋白酶可以直接和或间接破坏牙周组织，干扰宿主的免疫防御，并与机体其他系统疾病有着千丝万缕的联系，因此一直被认为是牙周病的潜在治疗靶点，而应用牙龈蛋白酶抑制剂辅助治疗牙周病具有较大的潜力。而现有抑制剂的生物安全性、稳定性和有效性，以及更优秀的抑制剂的开发仍需要大量基础及临床实验的支持。另外，牙龈蛋白酶在P.gingivalis细胞中的定位及编码调控，以及其对全身组织器官功能的影响尚待进一步研究。