季铵盐DMADDM抗菌改性牙科材料的研究进展

    口腔是人体第二大微生物群落聚居地。口腔微生态失衡可诱发多种口腔感染性疾病如龋病、牙髓病和种植体周围疾病等。牙体充填修复、根管治疗和牙种植术是目前临床常用的治疗方法，但不能彻底清除致病生物膜和预防继发感染。加之口腔结构复杂和唾液冲刷，局部应用抗菌药物也不能维持有效的药物浓度。因此牙科生物材料要维持长期的临床治疗效果，赋予其抗菌性至关重要。
    1994年，Imazato等首次合成了可聚合的季铵盐型抗菌单体——MDPB。此后，不同类型的季铵盐单体相继合成，并被添加至牙科材料中进行研究，如二甲基丙烯酸酯（QADM）、季铵化聚乙烯亚胺（QPEI）、甲基丙烯酸十二烷基二甲铵（DMADDM）等。
    其中DMADDM的烷基链较长，电荷密度大，抗菌性能较为优越且生物相容性好；并且通过与材料基质交联发挥长效抗菌作用，不会因为释放活性成分而影响材料的机械性能，因而在牙科材料抗菌改性方有着广泛深入的研究。因此，本文将对DMADDM在抗菌改性牙科材料的研究进展和耐药性研究等方面作一综述。
    1. DMADDM的结构和抗菌机制
    DMADDM是由甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和带有12个碳链的卤代烷通过Menschutkin反应形成的季铵盐型单体。为了使抗菌牙科材料具有良好的长效抗菌性、生物安全性和机械性能，DMADDM的结构设计具有以下特点：首先DMADDM的杀菌作用依靠的是季铵基团，该功能基团具有和阳离子抗菌剂一样的广谱抗菌效果，对革兰阳性和革兰阴性细菌、真菌、疟疾和病毒都具有较强的接触杀灭活性；其次，疏水性的长烷基链有助于DMADDM渗透破坏细胞膜从而提高抗菌效果；而DMADDM的反应基团——甲基丙烯酰基团，使DMADDM和树脂基质交联形成非释放型的长效抗菌材料且不会显著降低材料的机械性能。
    目前关于季铵盐类化合物的抗菌机制尚未明确。但普遍接受的是“接触杀菌”，即通过与细菌接触后，破坏其细胞膜的完整性使细菌裂解死亡。季铵基团中带正电荷的氮原子通过静电作用与带有负电荷的细菌细胞壁和细胞膜吸附到一起，亲脂性长链烷基尾端插入到细胞膜内与细胞膜中的蛋白层和类脂层结合，影响菌体和外界的交换过程并使细菌的胞质内容物泄露最终死亡。
    在针对链长对季铵盐抗菌性影响的研究中发现，链长增加，抗菌性相应提高，但存在阈值，即碳链长度增加到18以后，抗菌性开始降低。其中，链长为12的DMADDM在抗菌改性牙科材料方面表现较为优越。此外，Chen等发现DMADDM改性材料的抗真菌性能还受到了外界环境酸碱度的影响。
    其体内体外实验结果均证实，随着pH值的增加，相同浓度的DMADDM对白色念珠菌及其生物膜生长的抑制效果明显增强。这可能是因为在碱性条件下，白色念珠菌表面的zeta电位值较高，即其表面所带的负电荷较多，进而促进与DMADDM的粘附。
    2. DMADDM抗菌改性牙科材料
    口腔内的细菌多以生物膜的形式存在，定植牙齿、软组织及牙科修复材料表面。生物膜是细菌嵌入其自身产生的细胞外多糖基质中形成的高度结构化群体，相对于浮游菌具有更高的毒力和更强的抗药性。在许多口腔感染性疾病中，生物膜已明确认为是主要的致病因素。因此，为保证口腔疾病的远期治疗效果，防止细菌粘附和生物膜的形成，赋予牙科材料抗菌性也是目前的主要防治策略。
    2.1 DMADDM抗菌改性牙体修复材料
    当共生稳态的口腔菌群失调，变成产酸性、耐酸性细菌占优势的菌群，粘附在牙面的生物膜将引起牙齿脱矿和再矿化失衡，进而造成龋损。并且已经行充填治疗的牙齿也面临着继发龋的可能。因此通过抗菌改性牙体修复材料以降低继发龋的风险也是一直以来的研究热点。
    2.1.1 复合树脂
    复合树脂因美学性好、可塑性强和易操作等优点成为临床上广泛使用的牙体修复材料。但其自身无抗菌作用，较其他修复材料也更易积聚生物膜，导致修复体边缘形成继发龋造成充填治疗失败。因此，为增加复合树脂的临床使用寿命，Zhang等在复合树脂中添加DMADDM进行研究，发现改性复合树脂能够显著抑制唾液生物膜的形成以及降低微生物代谢活性。Maia等则通过体外研究证实改性后的复合树脂能够抑制变异链球菌的致龋作用，提高修复体边缘牙体组织的抗脱矿能力。
    2.1.2 牙科粘接剂
    牙本质粘接界面是复合树脂修复中的薄弱环节，细菌及其代谢产物易通过此部位入侵到牙本质深部，从而影响修复体的使用寿命。Chen等发现DMADDM改性预处理剂可以有效杀灭定植在牙本质小管内的变异链球菌，并且杀菌作用和DMADDM质量分数呈正相关。还有学者在粘接剂中同时添加DMADDM和聚乙二胺（PAMAM）构建兼具抗菌和矿化双重功效的防龋牙科粘接剂。
    其中DMADDM能有效降低生物膜的代谢活性，而粘接剂中的PAMAM 能够显著促进牙本质小管内新的矿物质形成。为了进一步验证DMADDM改性牙科粘接剂的防龋作用，Wu等首次成功建立了小鼠继发龋模型和改良Keye’s评分标准，并利用该模型验证了DMADDM改性粘接能有效抑制继发龋的发生。
    2.1.3 玻璃离子水门汀（GIC）
    玻璃离子水门汀独特的释氟特性在一定程度上可防止牙齿脱矿，促进再矿化和抑制细菌生长。但有研究表明，GIC释放的氟离子不足以抑制充填体表面的细菌粘附和生物膜形成。因此，Wang等在玻璃离子水门汀中添DMADDM以加强GIC材料的防龋作用。实验结果表明改性GIC一方面能够明显抑制变异链球菌生物膜；另一方DMADDM能够增强GIC的释氟能力从而提高GIC的防龋效能。此外，Feng等研究发现DMADDM改性玻璃离子经水老化6个月后也未显著降低其在口腔原位模型中对细菌生物膜的抑制作用。
    2.2 DMADDM抗菌改性根管治疗材料
    细菌感染是导致牙髓炎症和根尖周病变的主要原因。有研究表明，以粪肠球菌为主的多种细菌感染是导致难治性根尖周炎的主要病原因素。为增强根管封闭剂的抗菌性，Liu 等将DMADDM加入根管封闭剂EndoREZ中进行体外研究。实验结果表明改性根管封闭剂能够有效抑制粪肠球菌、戈登链球菌、内氏放线菌和嗜酸乳杆菌多菌种生物膜的形成。同时也检测到添加2.5%及以下质量分数DMADDM不会增加根管封闭剂的细胞毒性；并且根尖封闭性和溶解度同对照组相比也无明显差异，表明DMADDM可以与EndoREZ树脂基质交联，成为非释放型的抗菌根管封闭剂。
    Kumar Tiwari等则将DMADDM作为一种根管冲洗液，在体外研究非交联状态的DMADDM单体对感染根管内细菌的杀灭作用。结果显示0.03%的DMADDM溶液对浮游菌的短期杀灭效果和2%氯已定（CHX）、5.25%次氯酸钠（NaOCl）无明显差异，并且对生物膜的破坏能力强于2%CHX，表明低浓度的DMADDM具有较强抗菌性能。
    在此基础上，该学者还探究了根管内残留的牙本质碎屑及死菌是否会影响季铵盐类冲洗液的效果，发现DMADDM溶液的抗菌作用有所下降，这可能是由于残留物阻碍了DMADDM和细菌的直接接触所致。但是该研究发现DMADDM和CHX一样，能够被牙本质吸附从而抑制细菌在牙本质表面和牙本质小管内的粘附，从而延长其抗菌效果。
    2.3 DMADDM抗菌改性义齿基托
    丙烯酸或聚甲基丙烯酸作为口腔材料有着广泛的应用，例如用作义齿、印模托盘和树脂基托等。到1946年，就有98%的义齿是由甲基丙烯酸聚合物制成的。但假丝酵母菌在义齿表面粘附引起的义齿性口炎是其面临的主要临床问题。其中，检出的假丝酵母菌属主要是白色念珠菌，约占75%。菌丝状态的白色念珠菌较酵母状态具有更强的病原性，通过入侵上皮细胞损伤组织致病。因此，对义齿基托进行抗菌改性，除了能有效抑制细菌的粘附外，对真菌的杀灭作用也是改性的关键之一。
    Chen等采用分层制备的方法，将DMADDM加入到了义齿基团材料中，不仅未明显改变材料的挠曲强度，表面粗糙度和机械性能；还发现改性树脂基托能够抑制其表面白色念珠菌生物膜的形成并减少菌丝状态下的白色念珠菌数量。
    Zhang等进一步模拟口腔环境，构建了以白色念珠菌为主的真菌-细菌生物膜模型，验证了含有DMADDM的义齿基托材料能有效抑制混合生物膜的生长和代谢，并且显著下调白色念珠菌的毒力基因粘附素ALS3和菌丝壁蛋白HWP1的表达。另外，动物实验证实加入少于6.6% 的DMADDM不会增加义齿材料的炎症反应，并且能够减少多菌种生物膜对口腔上皮细胞的损伤，减少其IL-18基因的表达，表明改性义齿基托材料具有良好的生物相容性。
    2.4 DMADDM抗菌改性钛种植体
    钛及其合金因其良好的生物相容性和力学性能，成为牙种植体的首选材料。但定植在种植体表面的细菌会破坏骨结合，并引发组织炎症，导致种植体修复失败。Li等用聚多巴胺（PDA）作为载体将DMADDM和羟基磷灰石（HA）负载到钛片表面制成新型抗菌涂层钛片。验证了该抗菌种植体材料能有效抑制唾液生物膜的形成；通过16SrDNA测序技术分析菌群组成发现，改性钛片能够降低唾液生物膜中奈瑟菌属和放线菌属的相对丰度，同时增加有益菌——乳酸杆菌的相对丰度，表明DMADDM能够对唾液生物膜的微生物生态进行调节，使之向健康状态发展。
    Zhou等对上述DMADDM改性材料开展了进一步研究，发现其具有预防种植体周围炎的“两时段”生物学性能，即第一阶段，通过DMADDM的释放抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌生物膜的粘附，减少严重感染发生的风险；第二阶段，DMADDM经过一段时间释放后毒性进一步降低，再加上HA的负载使得改性钛棒能够形成多孔结构以促进骨髓间充质干细胞细胞的粘附、生长、增殖和分化。因此，目前DMADDM改性钛种植体材料主要还是以释放抗菌为主，同时还考虑到了促成骨的需求。
    3. DMADDM改性牙科材料的耐药性研究
    DMADDM作为一种抗菌材料，耐药性也是制约其进一步转化应用的问题。目前已有学者开展了DMADDM耐药研究，包括耐药菌和持留菌。耐药菌研究方面，Wang等对DMADDM单体诱导8种常见的口腔细菌（变异链球菌、血链球菌、戈登链球菌、粪链球菌、放线菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌和中间普氏菌）产生耐药性进行了研究。发现CHX对照组诱导了4种细菌产生了抗药性，DMADDM组仅口腔常驻菌戈登链球菌产生了抗药性。目前针对DMADDM为代表的阳离子抗菌剂产生耐药菌的机制尚未明确，还需要进一步研究。
    持留菌研究方面，Jiang等发现DMADDM会诱导变异链球菌产生持留性，诱导出的持留菌在生物膜状态时对多种抗生素表现出耐受性。Lu等则对DMADDM诱导变异链球菌产生持留性的机制进行了进一步的探讨，发现DMADDM诱导的持留菌在再生长的初期呈现出停滞期，随着时间延长，其致龋毒力相比于对照组明显增强。
    通过测序技术发现，和细菌生长及毒力有关的VicRK双组分信号转导系统中的VicR基因表达上调。分析其调控的下游基因，其中两个毒力基因的表达也明显上调，分别是调控EPS合成的gtfB 和gtfC，以及和产乳酸相关的ldh基因，提示DMADDM诱导的变异链球菌持留菌的产生可能是通过群体感应系统实现。
    4.总结
    口腔常见的感染性疾病如龋病、牙髓根尖周病、种植体周围疾病的发生和口腔生物膜密切相关，因此有效控制生物膜形成对防治口腔疾病的发生发展至关重要。众多研究表明，DMADDM具有良好的抗菌活性，能够抑制生物膜形成和调节口腔微生态平衡，表现出一定的临床转化前景。
    但DMADDM改性材料也面临以下几点问题：（1）该类型改性材料主要是通过接触杀菌，因此当唾液蛋白粘附其表面以及因磨耗等其他因素致非抗菌成分暴露于口腔时会降低抗菌效果。（2）目前普遍接受的观点是DMADDM通过破坏微生物生物膜的完整性以发挥广谱抗菌作用，但其具体的抗菌机制尚未明确，这也是阳离子表面活性剂所面临的主要问题；（3）针对DMADDM诱导耐药菌和持留菌的研究较少，尚未有明确的耐药机制以指导清除策略的制定；（4）目前的大多数研究为体外实验，将来的转化应用还需要进行更多的动物实验和进一步的临床研究支持。
    但是，随着研究技术的不断发展，以上问题将会被逐渐解决，从而使具有良好生物相容性和抗菌活性的DMADDM能够更好地投入到临床使用。