可注射型富血小板纤维蛋白应用于口腔组织再生的研究进展

    血小板浓缩物是一类富含血小板和白细胞的纤维蛋白物，能够释放大量的生长因子、趋化因子及其他炎症介质，有利于促进细胞增殖及分化。1998年第一代血小板浓缩物——富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）首次被应用于口腔医学领域，但由于添加外来抗凝制剂，其使用受到了限制。
    Choukroun等于2001年研制出PRF，这种不含抗凝剂的第二代血小板浓缩物表现为凝胶状的纤维蛋白支架，能够包裹并持续释放细胞因子和生长因子，同时具有免疫调节、抗炎及抗菌作用，在口腔组织再生方面具有医学研究及临床应用价值。目前PRF的衍生物i-PRF因独特的生物学特性及操作便捷性，已广泛应用于口腔医学领域。本文针对i-PRF制备技术、生物学特性、作用机制以及在口腔组织再生方面的潜能与临床应用作一综述，旨在为合理应用i-PRF提供参考。
    1.i-PRF的制备技术
    从第二代血小板浓缩物PRF提出以来，为进一步提高血小板及白细胞富集量与延长生长因子的作用时间，各类PRF衍生物已广泛运用于口腔临床应用中。Choukroun等提出改变离心速率、缩短离心时间的方式可制得未凝固形式的PRF。制备i-PRF的采血管为不含任何玻璃涂层的塑料管，其疏水表面不能有效激活凝血过程，降低纤维蛋白的早期凝集；同时血液在离心过程中，低速离心概念（low speed centrifugation concept，LSCC）的应用有利于相对较小比重白细胞和血小板更多地存留于上层，最后在凝固过程中被网罗于纤维蛋白网络中。
    Miron等将10mL全血700r/min离心3min，血液分离为上层液体即为i-PRF。Mourao等则将9mL全血3300r/min离心2min，也获得橙色i-PRF液体。这种血小板产物应立即用针管收集，其液体形式可维持10～15min，之后逐渐转化成为凝胶态。临床应用时，i-PRF不需要剪切或者挤压成膜，可直接注射或联合其他生物材料使用。
    2.i-PRF的生物学特性与作用机制
    PRF的主体成分为三维立体纤维蛋白网状结构，其较大的孔隙能够网罗离心血液中约97%的血小板及50%以上的白细胞，同时大量的生物活性物质通过化学键与纤维蛋白支架稳定结合，保证了细胞因子的持续释放。Varela等研究i-PRF结构与生物学特性时发现，i-PRF由较外周血更粗壮的纤维蛋白条索（平均直径约为90nm）构成更为稳定、支撑力更强的网状支架结构，血小板及白细胞计数也更高。
    i-PRF中白细胞及血小板分布较PRF更均匀，后者的纤维蛋白条索粗细不均，细胞成分主要集中在靠近红细胞层1mm处的纤维蛋白凝块内，有助于标准化定义i-PRF细胞成分与结构。i-PRF高表达血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）及I型胶原蛋白（collegen type 1，Col-1）。与生长因子早期大量释放并在10d内完全溶解的PRP相比，i-PRF维持凝胶状态并释放生长因子超过10d。生长因子较长时间持续释放，更利于促进组织的愈合。
    i-PRF作为不含抗凝成分的液体血小板衍生物，具有独特的可注射性及对复杂缺损环境的适应能力。同时，低速离心的技术使获得的i-PRF中仅小部分血小板被激活，因此可维持溶胶状态约10min。随着血小板脱颗粒，凝血酶被激活，其内的纤维蛋白原被切割并发生交联，转化为凝胶态的血小板-纤维蛋白复合物，使得其与其他生物材料的联合应用成为可能。
    Mu等利用该相态变化特性，向i-PRF溶胶中添加明胶纳米颗粒，从而获得一种具有双网络凝胶结构的复合水凝胶，在增强机械性能的同时，缓释i-PRF内的生长因子。i-PRF与骨移植材料颗粒混合后，可在短时间内形成凝胶状态的生长因子富集的黏性骨，手术操作更为简单，利于凝聚并激活骨移植材料，进一步发挥其成骨潜能。
    3.i-PRF在口腔组织再生方面的潜能与临床应用
    3.1i-PRF与骨再生
    研究表明i-PRF具有良好的骨再生效果，能够加速骨缺损愈合，可能归因于其释放的生长因子调节。Wang等体外研究证实i-PRF可增强成骨细胞的活性，诱导其分化、增加钙沉积，并增强ALP、OCN、RunX2及COL1A1等成骨相关基因的表达，具有促进骨再生的潜能。同时，由于其独特的流动性及可注射性，i-PRF可作为一类新型生物分子递送载体，增强局部细胞因子、血管生成因子、多肽等分子浓度，或作为抗生素、基因治疗和抗骨质疏松药物的局部输送载体。
    同时，i-PRF也可被用于细胞和纳米级颗粒的潜在载体系统，能够最大程度避免宿主排异反应的同时有效促进机体骨再生与软骨再生。骨移植材料仅能通过骨传导的作用促进骨祖细胞的迁移和附着，同时分泌生长因子以促进新骨的形成。然而在缺损区域较大或骨愈合过程受到干扰等情况时，周围的生长因子将会明显减少，此时联合使用血小板衍生物，能够通过其释放的大量生长因子显著提高材料的骨诱导能力，从而促进缺损区的愈合。
    PRF及其凝胶状的衍生物与骨移植材料的结合较为困难，而i-PRF除了能够单独注射使用外，也能够在液体形式时与骨粉颗粒充分混合，凝集后形成稳定且便于塑形的黏性骨块，能够更好地填充复杂形态的缺损区域。Kyyak等将i-PRF分别混合异种骨移植材料和同种异体骨移植材料后与人成骨细胞共培养后发现，i-PRF与骨替代材料的联用均显著提升了人成骨细胞的黏附、增殖及分化；同时研究指出i-PRF与同种异体骨移植材料的联用具有更高的促进成骨分化的潜能。i-PRF与骨移植物联合使用的黏性骨块在引导骨再生及位点保存技术中已得到广泛应用。
    黏性骨块除便于操作外，也利于创口关闭及初期愈合过程中保持移植骨形态及植骨区域轮廓，尤其是针对较大范围的植骨。Thanasrisuebwong等在利用黏性骨块进行大范围水平骨及垂直骨增量半年后，环钻获取植骨区域骨块进行组织学检查，结果显示新生骨形态及结构较好。
    另一方面，将i-PRF与骨替代材料混合后用于上颌窦提升术中，可增强成骨效果并缩短愈合时间。Mu等将脱蛋白牛骨矿基质（deproteinised bovine bone matrix，DBBM）及i-PRF联合用于兔上颌窦提升后发现，虽然i-PRF的添加并未增加最终骨体积，但在愈合早期促进了血管形成、骨改建及骨移植材料的替代。而使用胶原塞替代骨移植材料作为i-PRF的载体应用于上颌窦提升时，在胶原塞提供的空间维持作用以及Schnederian膜与骨祖细胞的成骨潜能的基础上，i-PRF的添加更有利于种植体周新生骨的形成。
    3.2i-PRF与软组织再生
    血小板浓缩物富含丰富的生物活性因子，近年来在牙周及种植体周软组织再生方面也有较多的研究。Wang等对比了i-PRF与PRP对在钛种植体表面培养牙龈成纤维细胞的作用时发现，i-PRF在细胞的增殖、黏附、迁移以及PDGF、TGF-β、Col-1和纤维蛋白连接素（fibronectin，FN）的表达上效果更佳，显示出i-PRF对于软组织再生方面的医学应用潜能。对于牙龈萎缩导致根面暴露的患者，自体软组织移植物已广泛应用于根面覆盖手术中，尤其是MillerI类或II类牙龈萎缩的情况。
    Izol等通过注射的方式将i-PRF作为游离龈移植瓣的根面生物修饰剂后，获得了更好的软组织量及根面覆盖率。而运用结缔组织移植物结合冠向复位瓣进行牙龈退缩的治疗时，i-PRF的添加有利于获得更多的角化组织及更少的术后退缩。软组织移植物的存活依赖于充足的血供以及良好的血管吻合形成。
    i-PRF在形成纤维蛋白凝胶后可将软组织移植物充分包裹，在作为三维支架稳固移植物的同时，也促进了毛细血管网的快速形成与血运重建。而PRF由于含有较多的血纤蛋白基质，易在受区形成较大的血凝块，不利于移植物建立良好的侧支循环。此外，大量生物活性因子的持续释放，尤其是TGF-β及PDFG等对于牙周组织再生具有显著作用的生长因子，能够促进成纤维细胞和上皮细胞的增殖与黏附，有助于软组织移植物的早期愈合及稳定。
    另一方面，Ozsagir等将i-PRF结合微针疗法应用于薄龈生物型患者，通过诱导成纤维细胞的增殖以及促进新生胶原与血管的形成，较好地增加了牙龈的厚度及角化龈的宽度。这提示了i-PRF应用于重建牙龈轮廓与形态，改善患者红色美学方面的可能性。
    3.3i-PRF与创口愈合
    i-PRF持续释放的生物活性物质能够加速创口愈合的过程，而预防术后感染、控制炎症反应也是促进组织愈合的关键因素。Zhang等已证实i-PRF在组织愈合的过程中具有潜在的抗炎作用，能够显著降低巨噬细胞的促炎作用，激活和趋化感染区域周围的树突状细胞。体外研究也表明i-PRF能够抑制脂多糖诱发的炎症，同时可能与炎症激活因子TLR4以及炎症相关的NF-κB信号通路关键因子p-p65相关。因此，在手术中或治疗炎症性疾病的过程中使用i-PRF能够减轻免疫反应，有利于加速愈合并缓解患者术后疼痛等问题。
    基于此，有学者将i-PRF应用于游离龈移植瓣的供区腭部创面时，发现其能明显促进创面愈合，减少出血等术后并发症的发生。i-PRF应用于治疗扁平苔藓以及浆细胞黏膜炎等疾病时也获得了显著的临床效果，能够减少病变周围炎症浸润，减轻患者疼痛症状。此外，细菌生物膜是影响创口愈合的关键因素，其通过促使细菌产生耐药性从而使创口长期处于炎症反应。
    Jasmine等提出，i-PRF对细菌及其生物膜均有明显的杀菌活性，在预防术后葡萄球菌感染方面具有应用潜能。Kour等则在对牙龈卟啉单胞菌及伴放线放线杆菌的抗菌研究中得到了相似的结果，且研究发现i-PRF的抗菌活性较PRF更高。利用i-PRF的抗菌潜能，Vikhe等提出使i-PRF在种植体周缓慢流动的改良种植体技术，有效抑制愈合早期生物膜的形成以及感染的发生。另有研究报道了对实验性牙周炎小鼠行根面刮治与根面平整术联合i-PRF应用，能够明显改善患牙附着丧失与探诊出血，同时牙周致病菌的含量也明显降低。
    3.4i-PRF与牙髓再生
    近年来，血小板浓缩物在牙髓再生方面的研究卓有成效。其释放的TGF-β等生长因子对间充质起源的细胞具有刺激作用，如牙髓干细胞。PRF碎片与牙髓干细胞制备成的新型移植物，在牙髓血运重建及牙髓-牙本质复合物的沿根管腔原位或异位再生方面具有临床应用潜能。Chai等认为i-PRF能够显著提高人牙髓细胞的增殖、迁移及分化能力，增加I型胶原蛋白、牙本质基质蛋白以及牙本质涎磷蛋白的表达。同时，由于i-PRF中富含的白细胞能够抑制牙髓炎时炎症介质的表达，减轻脂多糖引起的炎症反应，具有促进修复性牙本质生成的能力。i-PRF在牙髓再生方面的具体机制及体内应用效果仍需进一步研究。
    4.展望
    i-PRF来源丰富，取材便利，操作简单，是一种安全有效的生物材料。大量的基础与临床研究证明了i-PRF能够促进细胞的增殖、迁移及分化，同时具有抗炎作用与杀菌活性，能加速组织愈合，在口腔组织再生及相关疾病治疗中显示出极大的医学研究价值及临床应用潜能。但目前i-PRF在血管再生、免疫作用、潜在恶性病变的修复等方面仅局限于细胞实验、小样本的动物实验以及临床个案报道。关于i-PRF在缺损区域内部的生长机理以及应用于口腔疾病治疗的确切机制仍需深入研究。