牙髓炎性痛的中枢调控机制研究进展

    牙痛是口腔疾病中最常见的症状之一，2018~2020年上海第九人民医院口腔综合急诊科，以牙痛为主诉的患者占第二位。2018年11月~2019年3月首都医科大学附属北京口腔医院急诊科的非外伤牙痛患者中，牙髓源性疼痛占比最高，为51.5%。
    2020年疫情期间，北京大学口腔医院急诊接诊患者中因牙髓炎疼痛就诊比率最高。疼痛也是儿童就诊时不配合治疗的主要原因。丰富的神经分布是牙髓感觉到剧烈疼痛的生物学基础。牙髓中的神经主要来源于三叉神经的上、下颌支，这些感觉神经纤维束与血管伴行，自根尖孔进入，遍布于整个牙髓腔内。
    当牙髓发生细菌感染时，由于周围硬组织的阻碍，牙髓中的炎性渗出物引流不畅，牙髓腔内压力增高，牙髓神经中的C纤维和Aδ纤维将伤害性刺激传递至三叉神经节（trigeminal ganglion， TG）内，刺激进一步传递至三叉神经脊束核，并最终传递至大脑皮层，表现为牙痛。三叉神经脊束核位于脑干的脑桥段和延髓段，由上至下分为吻侧亚核、极间亚核和尾侧亚核（trigeminal spinal subnucleus caudalis，Ⅴc）。
    其中Ⅴc位于延髓下段，其细胞构筑形式与脊髓背角相似，故又称延髓背角（medullary dorsal horn， MDH）。三叉神经脊束核被证实是口腔颌面部信息从外周向中枢传导的第一门户，其中Ⅴc与疼痛信息的中枢传导密切相关。
    近年来，国内外的诸多学者都在研究牙痛的可能机制。然而，这些研究主要集中在牙髓和外周水平，牙痛的中枢调控机制研究较少。本文针对近年来牙髓炎性痛的相关文献报道，从疼痛传导过程中的Ⅴc处的神经元和小胶质细胞两个方面入手，对牙髓炎性痛的中枢调控机制进行总结，以期寻找到治疗牙髓炎性痛的更多靶点。
    1.牙髓炎性痛模型的建立及中枢作用位点定位
    1.1 牙髓炎性痛模型建立方法及鉴定
    牙髓炎动物模型在牙痛神经生物学机制的研究中发挥了重要作用。目前较公认的牙髓炎模型建立方法为牙髓暴露法。朱晓东等在水合氯醛麻醉下，采用1/4低速球钻磨除大鼠上颌第一磨牙牙釉质和部分牙本质，用牙科扩大针加压穿刺，暴露髓腔。HE染色显示髓腔开放1 d后，牙髓充血，穿髓点处可见少量炎细胞；3 d炎细胞聚集在穿髓孔周围；7 d炎症进展至根部及冠髓远处。
    此外，在牙髓暴露法的基础上，在露髓点处涂布芥子油（mustard oil， MO）或完全弗氏佐剂（complete Freund's adjuvant， CFA）等炎性制剂并暂封，可加速牙髓炎进程，并加重牙髓炎症。研究者可根据不同的实验目的和需求选用不同的建模方法。疼痛的行为学测定是检测模型成功和后续实验的关键，在揭示牙髓炎性痛的机制中发挥重要作用。
    目前对于牙髓炎模型的疼痛评估主要分为自发痛和机械性痛觉过敏两方面。自发痛即没有外界刺激情况下，机体自发产生的疼痛感，其主要依赖于观察实验动物的自发行为，如小鼠鬼脸量表（mouse grimace scale， MGS）和擦面行为等。Rossi等发现牙髓炎小鼠在损伤后24 h比假手术组有更高的MGS评分，提示自发痛。
    寇雯雯等发现牙髓炎小鼠与对照组相比擦面行为总时间延长，在炎症后1 d最长，7 d恢复，表明擦面行为是评估自发痛的可靠指标。机械性痛觉过敏是机体对疼痛反应增强的表现，即原先不会引发疼痛的刺激此时引发疼痛，von Frey纤维丝刺激实验是评估机械痛觉过敏的常用方法。Rossi等发现单侧牙髓炎后，von Frey纤维丝刺激导致双侧缩头反射阈值降低，在炎症后4 d出现，6 d最低，提示牙髓炎造成了疼痛的外周和中枢敏化。
    1.2 中枢作用位点定位
    解剖学研究证实Ⅴc接受来自牙髓的初级传入纤维的投射，并在疼痛传递中起重要作用。Wu等发现小鼠牙髓炎后2 h，Fos阳性神经元的数量显著增加，并聚集在炎症同侧三叉神经脊束核极尾间过渡区（the trigeminal spinal subnucleus interpolaris-caudalis transition，Ⅴi/Ⅴc）和Ⅴc的浅层（Ⅰ~Ⅱ）。
    该发现证实，牙痛的中枢作用位点位于Ⅴc浅层。近年来，一些研究结果表明Ⅴc处的神经元和小胶质细胞在牙髓炎过程中被激活，并参与疼痛的中枢调控，本文就Ⅴc处神经元和小胶质细胞在牙髓炎性痛中枢调控中的作用进行总结，以期望寻找新的治疗靶点。
    2. Ⅴc/MDH 中的神经元
    2.1 c-Fos
    c-Fos是细胞即刻早期基因，在基础条件下，表达水平较低，当外周痛觉刺激存在时，中枢神经系统（central nervous system， CNS）神经元中c-Fos基因及其蛋白产物Fos表达增加，因此c-Fos被广泛用作伤害性刺激后神经元激活的标志物。
    艾林等发现冷刺激牙髓可导致小鼠脑干三叉神经脊束核极间核（trigeminal spinal subnucleus interpolaris， Ⅴi）、Ⅴi/Ⅴc和Ⅴc中c-Fos表达增加。Cha等发现CFA诱导大鼠牙髓炎后，Ⅴc中的神经元表现出显著的c-Fos免疫反应阳性。Wu等电刺激小鼠牙髓后，在Ⅴc和Ⅴi/Ⅴc的浅层引起Fos的表达；在牙髓局部注射麻醉剂后，未观察到Fos的表达。
    顾斌等发现大鼠急性牙髓炎造成中枢致敏时，Ⅴc中c-Fos的表达显著增加，且c-Fos的变化时程与牙髓炎发展密切相关。上述研究结果表明c-Fos的表达与牙髓炎呈显著相关性，并可能参与牙髓炎性痛的中枢敏化。
    2.2 K+-Cl- 协同转运蛋白2（K+-Cl- cotransporter 2，KCC2）
    KCC2是成人CNS中的一种神经元特异性Cl- 输出物，其控制的低水平细胞内Cl- 浓度确保了γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid， GABA）A型受体产生快速的突触抑制。当炎症或神经损伤时，CNS中KCC2的表达会迅速且持续地下调，从而导致GABAA受体介导的抑制作用减弱。KCC2下调引起GABA 向兴奋性转化可能是其参与病理性疼痛的机制。
    有研究发现，对大鼠进行下牙槽神经横断后，GABA能中间神经元的功能从抑制性转变为兴奋性，这与Ⅴc中KCC2的下调有关。此外，一些研究在炎症性疼痛模型中观察到了KCC2的下调。Wu等在小鼠左侧触须垫皮下注射福马林模拟口面部疼痛，诱导小鼠擦面行为显著增加，且同侧MDH 中KCC2 mRNA 水平显著降低；在幼稚小鼠脑池内注射KCC2反义寡核苷酸后出现了与福马林注射小鼠相似的伤害感受行为，同时减少了KCC2的表达。
    Li等发现LPS诱导小鼠牙髓炎后，Ⅴc中的KCC2mRNA表达显著下调，KCC2可能在牙髓炎中的伤害性感受和牙痛的传递中起关键作用。KCC2迅速且持续地下调导致GABA 充当兴奋性神经递质可能是其参与牙髓炎性疼痛的机制之一。阻止KCC2的下调是治疗牙髓炎性痛的一种可能方法。
    2.3 降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）
    CGRP是一种在牙髓中高度表达的神经肽，其广泛分布在中枢和外周神经系统，并可导致神经源性炎症和疼痛性口面部疾病，包括牙髓炎和偏头痛。Castillo-Silva等的一项横断面研究显示不可逆性牙髓炎患者牙髓组织中CGRP的表达显著高于健康组。有研究发现，牙龈卟啉单胞菌LPS可直接激活三叉神经感觉神经元和非神经细胞，导致CGRP的释放和NF-κB核移位。
    张亚兰等发现偏头痛模型大鼠三叉神经脊束核中的CGRP表达与空白组相比明显增加，且针刺或西药干预组CGRP的表达显著低于模型组，说明三叉神经脊束核中的CGRP在偏头痛中发挥了重要作用。CGRP在中枢的表达是否与牙髓炎疼痛直接相关目前尚不明确，中枢表达的CGRP在牙髓炎性痛中发挥的作用可以成为未来新的研究热点。
    2.4 Nav1.7
    Nav1.7是电压门控钠通道家族的一个亚型，由SCN9A 基因编码，调节动作电位的产生和传播，在疼痛的外周信号传导中发挥重要作用，研究表明Nav1.7支持伤害性信息向CNS的传递，在中枢是否感知疼痛方面起到至关重要的作用。Sun等发现牙髓炎可导致大鼠TG 中Nav1.7和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase， ERK）的表达增加，且表达水平与炎性痛程度之间存在相关性，TG 靶向注射Nav1.7抑制剂可剂量依赖性地提高机械痛阈值并抑制ERK的表达。
    Kwon等发现抑制Nav1.7通道可以调节牙髓炎症后TG 的伤害性信号，缓解炎性痛。这些研究表明TG中Nav1.7在牙髓炎性痛中发挥重要作用。陶怀等在综述CNS电压门控钠通道亚型基因突变与癫痫发生的关系时，发现SCN9A 基因的突变会导致癫痫的发生，其可能机制为基因突变导致CNS 中Nav1.7通道结构和功能异常，产生重复异常放电。目前有研究发现Nav1.7在中枢神经系统中的表达，但其在牙髓炎性痛模型中有中枢表达的情况尚未见报道。
    3. Ⅴc/MDH 中的小胶质细胞
    3.1 小胶质细胞极化
    小胶质细胞是CNS的特异性免疫细胞，约占CNS所有细胞的10%~15%，作为组织常驻巨噬细胞，参与对损伤的反应，在疼痛的中枢敏化中也起到重要作用。静息状态下，小胶质细胞突起高度伸展和收缩，以发挥免疫监视功能。
    当小胶质细胞受到刺激后，根据激活的环境或因素的不同，出现两种激活类型:经典激活（M1）型和替代激活（M2）型。M1型小胶质细胞可由LPS、TNF-α或IFN-γ刺激生成，通过产生炎症细胞因子启动炎症反应，引起神经毒性效应；M2型小胶质细胞可由IL-4或IL-10刺激生成，可抑制炎症和促进组织修复，发挥神经保护作用。
    Gao等发现牙髓炎大鼠TG 中M2/M1比值在炎症后24~72 h明显低于对照组，2周后又逆转，表明炎症过程中，TG中M2和M1的变化趋势相反。寇雯雯等发现牙髓炎小鼠MDH 处M1的表达在炎症后1 d达到高峰，随后逐渐降低；而M2型细胞的表达在炎症后1 d开始升高，并于14 d达到高峰；疼痛行为学测定结果表明，炎症后1 d小鼠疼痛最明显，随后逐渐减弱，7 d后恢复正常。该结果说明小胶质细胞在牙髓炎初期以M1型极化为主，造成痛觉过敏；在炎症后期，以M2型极化为主，产生镇痛作用。
    3.2 P2X7R
    P2X7受体（P2X7 receptor，P2X7R）是一种非选择性阳离子通道，由细胞外ATP激活，可刺激多种致炎物质的分泌，如IL-1β等。存在于小胶质细胞上的P2X7R 在CNS的炎症和免疫中发挥重要作用。
    当ATP与小胶质细胞中的P2X7R胞外区结合时，细胞膜离子通道打开，Ca2+内流增加，激活小胶质细胞，通过信号通路的传导释放炎症因子，进一步作用于神经元和其他神经胶质细胞，促进突触传递，敏化中枢神经系统，导致神经病理性疼痛的发生。
    Yin等发现在三叉神经痛（trigeminal neuralgia， TN）模型中通过shRNA处理抑制P2X7表达可有效抵消TN 大鼠疼痛敏感性，降低TG中P2X7表达，IL-1β和TNF-α的产生及p38磷酸化。陈霞等发现急性牙髓炎期间大鼠损伤同侧Ⅴc及双侧丘脑腹后中核的小胶质细胞中P2X7R 表达增加。
    Itoh等发现大鼠MDH 持续鞘内灌注强效P2X7R拮抗剂亮蓝G和高碘酸氧化ATP可显著减弱MO 诱导的牙髓炎大鼠MDH 伤害性感受神经元中枢敏化；此外，单独灌注P2X7R 激动剂ATP 或BzATP 可激活P2X7R 并造成MDH 中枢敏化；小胶质细胞阻断剂米诺环素的灌注可消除MO 诱导的MDH 的中枢敏化。这些发现表明小胶质细胞中P2X7R的激活可能与牙髓炎性疼痛的中枢敏化有关。
    3.3 NLRP3炎症体
    NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor therinal protein domain associated protein3， NLRP3）炎症体由先天免疫受体蛋白NLRP3、接头蛋白ASC和炎性蛋白酶Caspase-1组成，可对微生物感染、内源性危险信号和环境刺激做出反应。NLPR3炎症体可以激活蛋白酶Caspase-1，促进IL-1β和IL-18的释放。Sun等发现大鼠TN 模型中MDH 小胶质细胞NLRP3炎症体在损伤后3~21 d逐渐增加；应用shRNA抑制NLRP3表达可显著抑制炎症因子的释放以及机械性痛觉过敏的激活。
    此研究表明MDH 处NLRP3炎症体的水平是TN的关键因素，抑制NLRP3炎症体的早期表达可能是TN 的潜在治疗方法。由于三叉神经是牙髓疼痛传导的必经之路，NLRP3炎症体可能参与牙髓炎性痛的中枢调控。
    4.小结
    牙髓炎是口腔科常见疾病，常引起剧烈疼痛，疼痛是儿童害怕和拒绝牙齿治疗的主要原因之一。本文回顾了既往关于牙髓炎性痛的中枢调控机制，在Ⅴc神经元中c-Fos蛋白的表达与牙髓炎症呈显著的相关性；KCC2迅速且持续的下调导致GABA 充当兴奋性神经递质可能是其参与牙髓炎疼痛的机制。
    小胶质细胞极化、P2X7R及NLRP3炎症体的表达上调可能与牙髓炎疼痛有关，小胶质细胞的表型之间存在相互转化，炎症初期以M1极化为主，后期以M2极化为主，M1极化与牙髓炎疼痛程度呈正相关；P2X7R 的激活可能与急性牙髓炎疼痛的中枢敏化有关；NLRP3炎症体可激活Caspase-1，促进IL-1β和IL-18等炎症因子的释放，导致炎性痛的中枢敏化。
    目前的研究发现CGRP和Nav1.7在牙痛外周传导中发挥着重要作用，其在中枢中的表达还有待进一步的研究。研究牙髓炎性痛的具体中枢调控机制，将有助于开发新型、针对特定部位的治疗方法。