心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是一组涉及心脏和血管系统的疾病，可以导致心脏和血管的损伤或功能障碍，包括心绞痛、心肌梗死、动脉粥样硬化、脑梗塞等，是人类常见的死亡原因。CVD的传统风险因素包括老龄、吸烟、不健康饮食、糖尿病、肥胖等。近年来随着研究越发广泛和深入，发现以牙周炎致病菌为代表的口腔微生物对CVD亦有显著影响。直接途径包括细菌从口腔转移到血液中并侵入心血管系统；间接机制涉及全身免疫途径的激活，导致并维持机体的非特异性慢性炎症状态。
其中，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)是革兰氏阴性厌氧杆菌，是牙周炎的主要病原体。P.gingivalis可以分泌大量的毒力因子，如牙龈素、吲哚、内毒素等，而牙龈素是突出的毒力因子。它不仅能通过降解蛋白质、多肽底物及胶原等侵袭破坏牙周组织，而且可以经由损伤的牙龈和破裂的血管进入血液，破坏血脑及血管内皮屏障，扩散到脑、心脏等器官，导致血栓形成，损伤心肌细胞等。
此外，牙龈素还可以引发机体的免疫反应，使炎症介质进入血液循环，加速动脉粥样硬化等CVD的进展。因此，牙龈素不仅影响口腔健康，也促进了CVD的发生发展。本文结合相关研究，对牙龈素的生物学特征、牙龈素和CVD的致病机制研究以及伴有牙周炎的CVD进行综述，以期为牙周炎患者人群防治CVD提供新的思路。
1. 牙龈素的生物学特征
牙龈素最初称为胰酶样蛋白酶，是存在于P.gingivalis外膜、囊泡或胞外的一组半胱氨酸蛋白酶。作为“管家”酶，在P.gingivalis的致病机制中发挥关键作用。牙龈素对剪切肽键P1位的精氨酸或赖氨酸残基具有严格的特异性。据此，将其分为精氨酸牙龈素(arginine-gingipain，Rgp)和赖氨酸牙龈素(lysine-gingipain，Kgp)。
Rgp能特异性切断蛋白质中与精氨酸残基结合的肽段，包括RgpA和RgpB两种存在形式。RgpA的分子量是95kDa，包括氨基端(N 端)的前肽区、蛋白酶区及羟基端(C端)的黏附区，其中黏附区对P.gingivalis 降解血红蛋白、摄取血红素尤为重要。而RgpB不含黏附区，仅有与RgpA 相应段紧密相关的前肽区和蛋白酶区，其分子量相对小，为50kDa。Kgp则能特异性切断与赖氨酸残基结合的肽段，分子量是105kDa，组成与RgpA 相似，也包括前肽区、蛋白酶区和黏附区。
牙龈素的分泌和活化是一个复杂的过程，当牙龈素刚被翻译时，以无活性酶原的形式存在，阻断细胞内不需要的蛋白水解酶活性。经过翻译后加工，牙龈素转化为具有催化活性的蛋白酶，转运到细胞外环境中。目前，在破译牙龈素到达菌体表面的分泌和成熟过程方面取得了较大进展。它具有典型的N端信号肽，通过Sec系统穿过内膜。在此过程中，信号肽被信号肽酶Ⅰ去除，新暴露的N端谷氨酰胺被定位于内膜胞质面上的谷氨酰胺环化酶环化为焦谷氨酸。
在胞质中，牙龈素通过其C端结构域被定位到新发现的TypeⅨ分泌系统(typeⅨsecretion system，T9SS)，以便跨外膜转运。胞外表面，T9SS的组分表面相关分选酶PorU切割C端结构域，并将产生的新末端与阴离子脂多糖结合，从而将蛋白锚定在细菌表面。其中RgpA和Kgp能形成大的多结构域、多功能复合物，参与蛋白水解、血细胞获取、血小板活化、红细胞凝集、细胞外基质的黏附等。
2. 牙龈素和心血管疾病的致病机制研究
2.1 破坏血脑屏障
血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是脑低通透性的关键结构和功能屏障，存在于血液循环系统和中枢神经系统之间，是防止微生物或其毒力因子进入脑组织的第一道防御屏障。脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelialcells，BMEC)、周细胞、星形胶质细胞和基底膜是BBB的重要组成部分。
Nonaka等研究表明，牙龈素可以直接降解BMEC中的闭锁小带蛋白-1和闭合蛋白(均属于紧密连接蛋白)，导致细胞单层的通透性增加。用P.gingivalis培养上清液后，免疫组织化学染色结果显示牙龈素存在于细胞质和细胞核中。此外，牙龈素可能通过外膜囊泡递送进入BMEC，降解细胞内的紧密连接蛋白，继而导致BBB的损伤。最近研究发现，在患牙周炎期间，小鼠牙龈和脑组织的细胞外囊泡或外泌体含有牙龈素，并且使用BBB人体三维体外模型表明，牙龈组织中释放的细胞外囊泡或外泌体通过降解紧密连接蛋白，增加BBB通透性促进BMEC功能障碍。
BBB破坏的主要特征是转胞吞作用增强及紧密连接结构被破坏。促进调解蛋白超家族2A(major facilitator superfamily domain containing2a，Mfsd2a)是一种BBB特异性脂质转运蛋白，也是转胞吞作用的关键抑制剂。P.gingivalis 在体内外均能显著抑制BMEC中Mfsd2a蛋白的表达。缺乏Mfsd2a脂质转运功能的小鼠由于转胞吞作用上调而出现BBB渗漏。
小窝是转胞吞过程的典型结构，为大小50~100nm 的瓶状细胞器，可调节物质内吞、信号转导和细胞骨架。小窝蛋白-1(caveolin-1，cav-1)是小窝最重要的结构蛋白，已被证明在调解P.gingivalis 在人口腔上皮细胞中的内化中至关重要。有研究发现，牙龈素中RgpA能够与Cav-1 以强氢键结合，并促进Cav-1 的表达，Cav-1介导的转胞吞作用导致BMEC通透性增强。而BMEC中的Mfsd2a过表达会降低Cav-1的表达，P.gingivalis 通过抑制Mfsd2a表达和上调Cav-1表达增加BBB的通透性。
2.2 破坏血管内皮屏障
血管内皮钙粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)，在内皮屏障功能和血管生成中起关键作用。Farrugia等使用斑马鱼幼虫感染模型表明，P.gingivalis可以侵袭不同血管床的单层内皮细胞，但与口腔上皮角质形成细胞相比，水平较低(~0.1%)。此外，牙龈素缺失的突变体ΔK/R-ab未能侵入内皮细胞，表明牙龈素对破坏血管内皮屏障这一过程至关重要。P.gingivalis 通过牙龈素降解血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)和VE-cadherin这一机制来介导体内血管损伤和内皮通透性增加，可能导致动脉粥样硬化性CVD。
有研究应用血管化的三维牙龈模型，使用胶原微纤维表达细胞-细胞连接的上皮屏障，以实现动态分析P.gingivalis 的侵袭过程。在牙龈上皮细胞层，P.gingivalis 是通过细胞间而非细胞内途径进入深层上皮细胞的。与上述结果相似，在毛细血管内可以发现P.gingivalis，且2d后其数量大大增加，而牙龈素缺失的突变体存活率则显著降低，说明牙龈素的存在有利于P.gingivalis的存活及破坏血管内皮屏障
P.gingivalis可通过影响经内皮迁移(transendothelial migggration，TEM)逃避白细胞杀伤。各种内皮连接分子，如PECAM-1、CD99和CD99L2等，都参与TEM。PECAM-1是参与血小板黏附和聚集的关键因子，牙龈素能降低PECAM-1的表达来增加血管通透性。牙龈素还可以刺激内皮细胞和白细胞上的CD99和CD99L2表达降低，影响白细胞的TEM，该过程与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidy linositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)途径相关。
2.3 影响血栓形成
在CVD的进程中，血栓是一个至关重要的因素，血栓的形成与心肌梗死、缺血性中风、外周动脉疾病和肺栓塞的发生密切相关，并对疾病的发展和预后产生影响。血小板是血栓的主要成分，会被快速募集到内皮损伤区域，以维持宿主止血平衡。此外，它还能通过Toll样受体等识别与病原体相关的分子模式，招募炎性免疫细胞，在先天免疫中发挥重要作用。
早期研究发现，牙龈素可以激活血小板表面表达的蛋白酶激活受体1和4，以nmol浓度诱导人血小板胞内钙离子增加，使血小板呈浓度依赖性聚集，形成血栓。这不仅表明P.gingivalis 新的致病特征，也解释了牙周炎与CVD 之间的联系。随后有研究得出了相似结论，即血小板与P.gingivalis之间相互作用，牙龈素(尤其是Rgp)可诱导细胞内游离钙离子动员促进血小板活化，形成大而致密的血小板聚集体。并且该研究还阐明了牙龈素可以对血小板衍生的细胞因子和趋化因子进行蛋白分解，从而拮抗免疫系统。
然而，Nunes等研究了RgpA对健康个体血浆中凝块结构和凝块形成的影响，结果却发现，RgpA导致血小板血浆中的血凝块形成明显变慢，纤维蛋白网络的形成减少，而且凝块强度普遍改变，表明RgpA对纤维蛋白原结构血凝块的蛋白水解作用，P.gingivalis影响血浆的结构和力学。上述研究结果的差异，很可能是由于血浆中存在抑制和靶分子，如白蛋白和其他蛋白质，它们存在于包括Ⅱ型糖尿病在内的各种CVD患者的血液循环中，也许会对血液凝固产生更深远的影响。
近来研究还发现，牙龈素与血液循环中的中性粒细胞和血小板相互作用，促进血小板激活和血栓形成，增加动脉闭塞的风险。并通过增加血栓中的中性粒细胞含量、影响血栓的组成和血管内治疗的反应，从而在缺血性CVD中发挥作用，影响疾病预后。
2.4 损伤心肌细胞
在CVD中，心肌梗死仍然是导致死亡的主要原因。当冠状动脉内的血流被斑块或血栓堵塞时，会导致心肌的营养物质和氧气供应不足，心肌损伤坏死。
有研究发现P.gingivalis 感染能促进心脏破裂及p18Bax(BCL2-associated X)的积累(一种促凋亡Bax蛋白的活性形式)，还可以入侵缺血的心肌。其分泌的牙龈素在精氨酸34位点直接裂解野生型Bax，导致线粒体膜的破裂，显著增加了心肌细胞的凋亡。此外，P.gingivalis 通过影响受损线粒体的清除，增加了心肌中的氧化应激水平，进一步加重心肌细胞损伤。并且可以使基质金属蛋白酶9的表达和活性增加，继而导致心肌基质的降解，增加心脏破裂的风险。
后续该课题组进一步研究表明牙龈素通过切割囊泡相关膜蛋白8(vesicle-associated membrane protein 8，VAMP8)的赖氨酸47位点及突触融合蛋白17(syntaxin 17，STX17)，损害STX17-SNAP29-VAMP8复合物的稳定性，抑制自噬体-溶酶体融合，从而抑制自噬通量。自噬体形成和溶酶体降解之间的不平衡可能导致自噬体过度积累，使细胞内部的废物清除和受损细胞器的回收障碍，导致心肌细胞肥大和多聚泛素化蛋白的积累，最终增加心脏破裂的发生率。
2.5 促进炎症反应
越来越多的证据表明，CVD中的低度炎症是导致发病和死亡的重要原因。慢性牙周炎是炎症的上游，可改变的诱因和引发者之一，其中P.gingivalis引起的多种微生物感染，在其发病机制中起着核心作用。P.gingivalis 通过牙龈素降解IgG、IgA、补体成分和防御素等重要的免疫因子，调节免疫炎症反应。它激活基质金属蛋白酶，促进炎症介质和前列腺素的释放，抑制蛋白酶抑制剂，减少受体表达，抑制吞噬细胞的呼吸爆发。
此外，牙龈素可诱导促炎因子白细胞介素-1β(interleukin-1beta，IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的分泌，IL-1通路在病原体加速动脉粥样硬化中起重要作用，从而增加CVD的患病风险。
核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎症小体是炎症小体家族中最典型的成员，是一种多蛋白复合体，通过激活Caspase-1，诱导炎性细胞因子IL-1β和IL-18的成熟。NLRP3蛋白在牙周炎患者的牙龈组织和冠状动脉粥样硬化患者的主动脉中表达上调。牙龈素是NLRP3炎症小体活化的重要毒力因子，还能诱导巨噬细胞中促炎细胞因子的产生，导致炎症持续并促进动脉粥样硬化发生发展。
基于上述研究，牙龈素通过多重机制促进CVD的发生发展，但具体的致病机制仍需进一步研究明确。
3. 牙龈素和伴有牙周炎的CVD
牙周炎和CVD都是慢性炎症性疾病，具有共同的危险因素，如吸烟、糖尿病、年龄等。二者之间有显著相关性，可能的机制包括内皮功能障碍、全身炎症、免疫反应和牙周病原体及其毒力因子的作用。以下笔者将重点总结牙龈素在牙周炎与CVD相互影响中的作用。
3.1 牙周炎对CVD的影响
大量研究表明，牙周炎是CVD的危险因素之一。相关机制通常分为两类:微生物侵袭和感染；炎症和免疫。在牙周炎的致病过程中，牙龈素可以促进P.gingivalis 的黏附，参与其他细菌的共聚集，降解胶原蛋白、辅助破骨细胞等破坏牙周组织，影响毛细血管通透性，抑制血液凝固，增加牙周组织出血。并且它还能调节免疫反应，影响免疫介质的产生，导致细胞损伤、细胞凋亡和炎症。
在牙周炎晚期，P.gingivalis及其毒力因子牙龈素可以通过洁治、手术等治疗方式进入血液，经由血液到达远处器官，影响亚急性心内膜炎、冠状动脉粥样硬化性心脏病、动脉粥样硬化和缺血性心肌梗死的发生发展。慢性牙周炎的活动期，会引起轻度而持久的全身炎症反应，从而导致动脉粥样硬化等CVD的风险增加。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是由中性粒细胞来源的覆盖有抗菌分子的DNA组成的胞外纤维网络，能有效地捕获和杀死细菌，是公认的固有免疫的生理性杀菌机制。
NETs的释放可导致炎症、血栓形成和组织损伤，与牙周炎及CVD的进展密切相关。研究发现，P.gingivalis 通过牙龈素依赖的中性粒细胞表面蛋白酶激活受体2的裂解来触发NETs的形成，但通过这种方式形成的NETs缺乏抗菌活性。这里牙龈素起着双重作用，虽然是NETs形成的直接诱导剂，但它也可以有效降解NETs中的抗菌成分，包括抗菌肽LL-37、防御素、中性粒细胞弹性蛋白酶等，从而保护了P.gingivalis的生长，并且使整个生态失调的微生物群落受益。
3.2 CVD对牙周炎的影响
一项基于人群的研究发现，心血管健康(cardiovascular health，CVH)评分与牙周炎的发生率呈负相关。即CVH 总评分越高，表明心血管健康状况越好，牙周炎的发生率越低。与CVH 较低的参与者相比，CVH 较高的参与者患牙周炎的患病率可以降低40%。CVD的存在会加剧牙周炎的进展和严重程度。高血压和动脉粥样硬化等CVD 可能会影响流向口腔组织的血液，从而干扰牙周组织的免疫反应和伤口愈合。尽管CVD和牙周炎之间的联系受到了极大的关注，但CVD对牙周炎的影响却鲜少研究。鉴于此，2020年共识报告得出结论，目前没有足够的线索支持CVD是牙周炎危险因素的假设。
关于CVD通过特定病原体或其毒素(如牙龈素)直接影响牙周炎发生发展，尚未有明确证据。因此，需要更多研究来探索它们之间的潜在联系和作用机制。
4. 结语
综上所述，牙龈素作为牙周致病菌P.gingivilis最突出的独立因子，可以通过破坏血管内皮屏障及BBB，影响血栓形成，损伤心肌细胞，引发机体免疫反应，促进全身炎症等机制，影响CVD的诱发和进展。目前，我们对CVD病因的认知已由原来遗传和饮食的单纯病因，转化为有感染和炎症因素参与的多病因模式。对牙龈素的深入探究，不仅为牙周炎与CVD之间的关联提供更多依据，也为这两种疾病的防治开辟新的思路。
