持续性根尖周炎根管内外生物膜特性的研究进展

2019年8月21日 国际口腔医学杂志

    持续性根尖周炎(persistent apical periodontitis,PAP)又称为难治性根尖周炎(refractory apical periodontitis),是指通过反复的根管治疗,窦道仍不愈或根尖周病变持续存在的慢性根尖周炎。研究表明,PAP与根管内外存在的微生物的定植和感染有关。根外生物膜附着于根尖区牙骨质或超填的牙胶尖表面,大多数学者认为其来源于根管内生物膜,但其是否仍依赖于根内感染存在目前仍不确定,本文从PAP与生物膜的关系、根管内外生物膜细菌组成的异同及其依存关系等方面对PAP的病因进行进一步探讨。

    1. PAP与生物膜的关系形态学及组织学

    研究显示,PAP根管内外均存在细菌生物膜,但根管内外细菌生物膜组成有所不同,根管内生物膜以丝状和分支状细菌为主导。Nair等通过光学显微镜和透射电子显微镜对6例PAP患牙根尖进行观察,发现根管内有生物膜覆盖,其内有大量的革兰阳性的丝状及分支状细菌。Carr等通过根尖手术获取非手术再治疗失败患牙根尖组织,透射电子显微镜观察发现根管内大量生物膜结构,几乎所有的细菌都被包裹在由不同变性阶段的细菌组成的多层的厚的细胞外基质中,其中可见凋亡细胞、影细胞以及分裂细胞。根外生物膜既可由单一菌种构成,也可由多菌种共同组成,以球菌、杆菌和丝状菌为主,也可见到螺旋体及真菌存在。

    Wang等和Sousa等分别对35例及20例PAP患牙根尖外表面进行扫描电子显微镜观察,均检出根外生物膜的存在,其内含有大量棒状菌和丝状菌。Su等在扫描电子显微镜下发现,PAP患牙接近根尖孔牙根表面紧密堆积有微生物和细胞外基质,在纤维束和细胞之间的不规则表面以及隐窝和孔中可观察到细菌斑块,细菌形态类型以球菌和杆菌为主。Wang等发现PAP患牙菌根尖外表面均有生物膜,具有球状、丝状、芽胞杆菌、杆菌的形态学多样性。Ferreria等在难治性根尖周炎患牙根尖生物膜中观察到真菌的存在。

    2. 根管内外生物膜细菌构成的区别

    微生物群落分析通常采用传统的细菌分离培养的方法,但影响培养的因素很多,随着分子生物学方法的进步,例如,扩增聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物的指纹图谱、棋盘杂交、定量PCR等方法广泛应用,可以检出更多无法培养的微生物。如今高通量方法也逐步开始应用于口腔内微生物的检测,包括微阵列、下一代测序技术、宏基因组学等方法。

    2.1 细菌培养法检测出的细菌种类

    使用传统培养的方法通常会遗漏难以培养的细菌,从而低估与持续性疾病相关细菌群落的多样性。大量研究采用细菌培养的方法显示,PAP根管内生物膜仅能检测到一种或几种菌种,由厌氧菌主导,革兰阳性菌比例较高,其中粪肠球菌最常见。Łysakowska等对28例持续性根尖周病变的患牙进行再治疗,在根管内检测出微生物以链球菌、肠球菌、丙酸杆菌属、放线菌属及乳杆菌属为主。根外细菌生物膜采用传统培养的方法可见多种细菌混合感染,以厌氧菌为主导。

    Tronstad等对8个无症状PAP患牙的根尖周软组织病变和根尖表面微生物进行培养,发现分离培养的细菌以厌氧菌为主,包括产黑色素拟杆菌、表皮葡萄球菌、放线菌属、兼性链球菌属及革兰阳性厌氧杆菌和球菌等。

    2.2 非培养方法

    近年来,用分子生物学方法检测微生物的多样性,对尚不能进行培养的细菌进行检测鉴定,根内、外生物膜的细菌组成发现,根管内生物膜肠球菌、链球菌及梭杆菌检出率较高,其中粪肠球菌最为常见,并检测出许多难以培养的细菌,例如D. invisus、Synergistes clone BA121等。根外生物膜以放线菌属、丙酸杆菌属、梭杆菌检出率较高。

    2.3 高通量方法

    非培养方法通过分析单一的病原体及病原体的分布及其与根尖周疾病之间的关系,从而提高对PAP根尖微生物群的了解。采用高通量的方法对根管内生物膜进行分析发现厚壁菌门、变形菌门和梭杆菌门的检出率较高,但对根外生物膜采用高通量方法进行群落分析的研究较少。Siqueira等对10例PAP患牙的根尖进行冷冻研磨提取根管系统内微生物,采用Illumina测序方法进行群落分析,发现超过85%的序列属于变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和放线菌门,其中变形菌门的检出率最高。

    Ping等通过根尖手术收集了20例PAP患牙的根尖部分,将根尖样品进行低温研磨进行454-焦磷酸测序分析,其中厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门、放线菌门、互养菌门和螺旋体门均为最具代表性的门。

    Hong等及Keskin等通过高通量焦磷酸测序的方法发现持续性感染的根管内与初次感染的根管内细菌种类无明显差异,但Tzanetakis等的研究认为相比于初次感染,持续性感染根管内变形菌门及柔膜菌门显著增多。

    目前提出许多可以提供关于群落生理和功能的宝贵信息的方法,例如宏基因组学(直接从环境/中获得的DNA的全基因组分析),转录组学(RNA表达分析),蛋白质组学(大规模蛋白质表达分析)和代谢组学(代谢物剖面分析),已经开始应用于牙髓病学研究,Provenzano等对10例PAP患牙行根尖手术,根尖周肉芽组织及根尖冷冻研磨后均进行蛋白质组学分析,发现一些与致病性相关的蛋白质,包括与抗药性,蛋白水解功能,黏附和毒力相关的蛋白质,且与肠球菌种、放线菌种、痤疮丙酸杆菌、链球菌、普雷沃氏菌等细菌有关。这些方法有可能公开与临床症状相关的分子模式,从而可能起到预测结果的作用。

    3. 根管内生物膜与根外生物膜的依存关系

    大多数学者认为根外生物膜来源于根管内生物膜,根管内细菌可能通过根尖孔、侧支根管或通过根表面牙骨质被吸收的区域中的牙本质小管到达根尖周组织,从而形成根外表面生物膜。其次在根管治疗过程中,根管内细菌也可能被推入根尖周围组织。此外,Kishen通过对根尖部液体运动分析测量证明,咬合可能导致细菌从根管内转移到根尖周组织。但根外生物膜是否依赖于根内生物膜存在至今仍存疑,已有大量研究对不同牙齿的根管内外的细菌组成进行分析,发现其检出种类及检出率等均有所区别,但对同一患牙根管内外生物膜的比较研究较少。

    3.1 同一患牙根管内外生物膜形态学分析

    Tronstad等对PAP患牙的根尖进行扫描电子显微镜观察,发现根尖外表面处的细菌嵌入根尖孔外无结构组织中,推测其来源于根管;根尖侧方的细菌生物膜通常在软组织覆盖的隐窝或孔的内部或周围存在,间接表明这些区域的微生物也可能来自根管内。一些研究通过对PAP患牙根尖部进行组织学分析,发现根外生物膜与根管生物膜相邻,支持根外生物膜是根管生物膜的延伸这一假设。但也有1例病例报道对持续性低密度影的患牙进行根尖手术,病理报道为根尖周囊肿,囊内可检测出放线菌,但根管系统内无明显感染,此病例提示在某些特殊情况在独立于根管内感染的根外感染可能是引起持续性病变的原因。

    3.2 同一患牙根管内外细菌构成的异同

    对同一患牙的根管内外样本进行取样进行细菌群落分析的研究较少,Noguchi等对PAP患牙研究发现,根外生物膜内检测到的细菌从同一牙齿的根管中的检出率为86.7%,从而认为残留在根管中或从瘘管侵入的细菌可能成为根外生物膜的主要来源。Kuremoto等采用单纯髓腔开放法建立大鼠根外生物膜模型,通过实时PCR对根管内外生物膜进行分析,在根管及根尖外表面检测出了相似的细菌物种,认为根管内细菌进一步发展形成根外生物膜,根管内生物膜的残留细菌增加根外生物膜形成的可能。

    4. PAP感染控制的方法

    根管治疗及再治疗后仍然不成功是根尖手术的适应证,通过切除患牙根尖1/3、倒预备及倒充填的方法去除根尖部的感染,研究发现PAP患牙采用根尖手术的方法具有良好的长期预后。Wang等对81名患者进行前瞻性队列研究,显微根尖手术后12~30月进行复查,愈合率达到90.5%。根管再治疗配合根尖手术是目前最值得推荐的方法。

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