口腔牙周病是一种慢性非特异性疾病，其发病率在我国高达70%~85%，是中老年人失牙的主要原因。但目前对于牙周疾病的重视程度，诊疗水平等都存在缺陷。牙周病病程长，早期变化不明显，临床诊断主要依靠临床牙周检查指数和X线数字减影技术。但这种诊断具有一定的滞后性，不能对牙周风险进行早期评估，也不能对牙周病活动性做出及时评价。
随着分子生物学及生物检测技术的不断发展，很多学者开始重视对牙周炎活动期龈沟液内生物标志物的研究。龈沟液（gingival crevicular fluid）是唯一的、直接从体液渗出的液体，其含量和成分的变化与牙周组织关系密切，可给牙周健康状况的评价提供重要的量化指标，有助于提高临床诊断效率和准确率，改善因临床诊断和治疗的不及时造成的牙周不可逆损害。而且由于龈沟液可重复取样，取样具有无创性，能最大限度减少不适感，故龈沟液是目前很有前景的诊断信息来源。本文旨在对近年来龈沟液主要生物标志物及常用检测技术作一总结，分析龈沟液检测的临床应用前景。
1.牙周疾病状态下龈沟液炎症成分的分析
健康牙周位点由于渗透梯度的改变也会出现少量龈沟液，并且含有与血浆或组织间液相似的成分如蛋白分子、细胞因子等，但含量甚微。当牙周发生炎症并伴随炎症的进展，龈沟液成分也发生相应的变化，龈沟液含量升高，大量炎症分子释放。这些炎症成分主要可分为3类：酶类、炎症介质、组织破坏产物。牙周炎发病机制的复杂性决定了龈沟液炎症介质的复杂性。导致牙周出现不可逆损伤的一个重要因素是菌斑生物膜与宿主免疫炎症反应的失平衡，过大的炎症反应除了对抗细菌侵袭外还会造成自身组织的损伤，龈沟液内出现大量炎症介质和组织破坏产物。
首先，炎症细胞释放如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、PGE2、RANTES等与免疫炎症相关的细胞因子，它们介导牙周炎整个病理变化进程，与炎症程度关系密切，也是目前研究最多的龈沟液生物标志物；在细胞因子的作用下，中性粒细胞、成纤维细胞等会释放与组织水解有关的酶类如MMP、CTS等，它们不仅能造成结缔组织和骨组织的破坏，也可作为介质参与免疫炎症的调节。其中，MMP-8、MMP-9作为一组重要的蛋白酶，常被作为研究牙周疾病的敏感标志物，在疾病位点的龈沟液内含量变化明显。
随着炎症的进一步扩大，牙周结缔组织甚至骨组织开始出现损伤破坏，如氨基多糖（尤其是4-CS）作为结缔组织主要组成成分，Hyp作为主要胶原蛋白成分，OPN作为骨基质成分，当牙周组织发生损伤破坏时释放到龈沟液中，可作为牙周炎症发生的证据。ICTP、RANKL为参与骨吸收破坏的介质，其含量的升高标志着牙周炎正处于活动期并发生着牙槽骨的吸收，所以它们不仅可以作为诊断标志物，也可作为牙周炎症预测标志物。这三类炎症成分都在一定程度上标志着牙周疾病的发生和发展，他们之间的相互作用构成了复杂的牙周免疫炎症网络，其相对含量的变化更与炎症程度关系密切。
从目前的研究来看，炎症介质作为生物标志物受到更多学者的重视，不仅因为其出现于炎症早期并参与整个炎症过程，与炎症程度关系密切，大量有关商品化的试剂使研究者对于龈沟液细胞因子等的研究能更加方便和深入；酶类与组织破坏关系密切，对于它们的早期检测，可预测牙周损伤风险；组织破坏产物作为牙周实质性破坏的指标，虽然不如炎症介质更具早期预测性，但是能更准确地提供牙周活动性的证据。有些研究很好地利用了这三类标志物的作用，利用混合标志物组来对相关疾病进行研究；而对于早期牙周炎龈沟液的分析，选择更多的还是炎症介质类标志物；对于重度牙周炎的研究，很多学者倾向于对骨组织和结缔组织破坏物的研究。当然，根据实验设计和实验方法的不同，研究者对炎症指标的选择也不尽相同。
有文献总结，目前已发现超过90种以上龈沟液成分与牙周炎症相关，但是根据现有研究来看，龈沟液成分用于临床牙周疾病椅旁检测的明确指导性意见仍不统一。例如，还不能确定哪些指标对疾病诊断具有高度特异性和稳定性，研究较多的生物标志物也没有一个确定的能应用于临床的疾病阈值，部分生物标志物对牙周炎疾病程度及类型诊断的研究结果存在争议等。
可以说，牙周疾病的龈沟液诊断体系仍不完善，目前的研究多数还处于龈沟液成分与疾病相关性的验证性实验阶段，若要解决上述问题，尚需大量实验室及临床科学研究，最终实现对标志物的筛选和量化标准制定。
2.龈沟液的检测技术
龈沟液研究的流行也促使检测技术不断改进，用以诊断疾病的状态、活动性和治疗效果。但不可否认，龈沟液检测仍存在一定的劣势，如单个位点样本含量少，对检测灵敏度要求高；不能反映全口牙周状况，若需多位点分析则工作量巨大等。目前有研究提倡，应用较龈沟液量大且更易获取的唾液作为诊断牙周疾病的标志物来源，此方法虽然能较全面地评估口腔卫生环境和疾病状态，但对全口牙周状况及特殊位点的评价不具备特异性。考虑到敏感性和特异性问题，龈沟液依然是最有前景的牙周诊断信息来源。通过改进开发针对小样本量的高灵敏度检测技术，实现单样本高通量分析，使单次龈沟液检测所需样本量降低而检测效率提高，是未来龈沟液标志物检测的突破方向。单位点检测效率的提高也使多位点甚至全口状况评估更加方便。
对龈沟液标志物检测力求寻找一种快速，简便，准确，高通量，高灵敏度，价格低廉，可用于临床的即时检测技术（point-of-care testing，POCT）。不过目前相关研究仍停留在实验室检测阶段，尚未实现临床转化。就实验室检测来说，每一种检测方法都有自身的优势和劣势，而且根据实验设计的不同，选择的检测技术也不尽相同。目前，常用检测技术如ELISA、免疫印迹，每次只能对一种或几种成分进行检测，效率低且需样本量大，对于含量较少的龈沟液的检测显示出了弊端。光谱和放射免疫等，由于其技术的复杂性或者检测对象的局限性等因素，使用也较少。
随着免疫检测技术的不断发展，液相芯片技术显示出很大优势。它是在ELISA原理基础上发展起来的可以用于多种成分同时检测的高通量检测技术，虽然单次检测成本较高，但对于多种成分的检测平均每种成分的成本较ELISA低，而且所需样本量大大减少，是近年来实验室分析研究常用的技术手段。技术的进步同时也带动了实验设计和方法的创新，使龈沟液成分的研究更加广泛和深入。但由于其在龈沟液检测领域刚刚起步，目前有关龈沟液的研究应用最多的检测方法还是ELISA，但是高通量免疫检测技术是未来发展趋势。
不过，对于实现龈沟液临床椅旁检测的转化，不管是ELISA还是芯片技术都存在着价格高昂的缺点。免疫胶体金技术是在放射、荧光和酶标免疫技术之后发展起来的一项新的固相标记免疫检测技术，其简单快速，不需特殊仪器，高特异性，成本低廉的特点，使其成为目前最快的免疫学检测技术之一，也是推动POCT技术逐渐发展成熟的重要技术手段。目前，口腔领域已有应用免疫层析技术检测牙龈卟啉单胞菌的相关研究。对于龈沟液临床椅旁检测技术的开发，免疫胶体金技术也许是优势选择。
3.龈沟液检测的临床应用前景
除用于牙周疾病诊断和指导治疗外，龈沟液检测也逐渐向着多学科辅助诊断方向发展，包括正畸、修复、种植以及全身疾病方面都在寻求应用龈沟液检测技术对临床问题进行早期诊断及干预治疗。
目前，龈沟液检测用于临床疾病分析研究较为成熟的还是在牙周病领域，其在正畸、修复、种植以及全身疾病等领域的研究拓展也是建立在牙周炎症基础上。有实验证实，应力也可造成牙周组织微环境的改变，甚至组织破坏，导致龈沟液内炎症介质增加。故对龈沟液的检测也可提示口腔治疗方面异常生物力的使用，反映牙齿处于非正常应力状态。
根据这一结论，笔者认为龈沟液检测可以指导临床更合理使用应力进行口腔治疗及对治疗效果进行早期评价。另外，正畸治疗造成的食物嵌塞，冠修复造成的龈边缘刺激，种植体龈边缘设计不合理等常见并发症也是导致牙周疾病的局部促进因素。对于因失牙而进行的修复治疗，多数患者存在牙周风险，而目前临床并没有客观的修复治疗标准。利用龈沟液检测对牙周状态进行量化评估，可较客观地判断修复治疗时机。考虑到正畸修复及种植治疗的市场价格，若能对治疗前后的牙周风险进行及时准确评估，就能大幅降低治疗的失败率，减轻患者再治疗的负担。
一些系统性疾病与牙周炎关系密切，如糖尿病、心血管疾病、脑血管疾病、肥胖、类风湿关节炎等。研究发现，系统性疾病可增加牙周炎龈沟液炎症因子水平，促进牙周炎进展；牙周炎也可作为风险因子导致或加重某些疾病的发生，同时，牙周治疗或口腔卫生环境的改善也有利于全身疾病的改善；吸烟及妊娠等全身性因素会导致牙周风险指数的增高。不过，目前对于牙周疾病与系统性疾病相互关系的认识尚不完善，针对每一种系统性疾病仍需大量的科学研究，而龈沟液成分分析可以帮助研究者更好地了解这些相互作用的机制。研究制定用以评估牙周炎和系统性疾病关系更加准确和敏感的生物指标，是未来研究的重点。
4.展望
龈沟液检测能帮助研究者更好地了解牙周组织的病理变化，在指导口腔多学科临床风险评估及多种系统性疾病分析方面具有很大的研究意义，有望应用于临床成为新的牙周疾病诊断方法。基于临床应用前景的龈沟液体外诊断也给相关研究带来更加现实的意义。但是，就目前研究情况来看，无论是炎症标志物的选择还是检测技术的应用仍然没有形成较完备的研究成果，多数研究还停留在实验室阶段，尚无应用于临床的报道。
开展寻找高度特异性的龈沟液标志物分析研究，开展快速、简便、准确率高的临床椅旁龈沟液检测技术研究，被认为是最具潜力的研究方向。对于炎症标志物的分析，组织破坏产物较其他炎症标志物更具备诊断特异性，若结合高通量检测技术将组织破坏产物和与牙周组织破坏高度相关的炎症介质如IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、MMP等综合分析，那么结果用于牙周疾病早期诊断将更加具备可靠性。
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