唾液富组蛋白5应用于口腔疾病的研究进展

2023年1月31日 中国实用口腔科杂志
    富组蛋白(histatins,Hst)是存在于人类和高级灵长类动物唾液中的一种抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),可以保护口腔组织免受病原微生物侵袭,与多种口腔感染类疾病密切相关。它是一组富含组氨酸的中性和碱性蛋白质,具有广谱的抗菌活性,在目前分离出的诸多Hst中,Hst1、Hst3和Hst5占总含量的85%~90%。Hst是4号染色体上2个基因位点HIS1和HIS2的转录产物,Hst1由HIS1基因编码,Hst5是HIS2基因编码的Hst3的降解产物。
    Hst5作为唾液的组成成分,通过参与宿主的非防御系统,在口腔疾病的防治过程中发挥着重要作用。Hst5具有多种生物学功能,如抑制或杀灭念珠菌、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、变异链球菌(Streptococcus mutans),抑制宿主和细菌蛋白酶,以及中和脂多糖等作用;其还具有抗菌力强、毒副反应小等优点。研究Hst5生物学作用对口腔念珠菌病、牙周病、龋病等多种口腔疾病的防治具有重要的临床意义。本文就Hst5应用于口腔疾病的研究进展做一综述。
    1.口腔念珠菌病
    口腔念珠菌病(oral candidiasis)是由念珠菌属一些致病菌种引起的原发或继发感染,常见于新生儿和免疫功能低下、唾液量减少、糖尿病及义齿佩戴者,其主要致病菌为白色念珠菌。白色念珠菌是人类常见的真菌病原体,除定植在口腔外,还可作为共生微生物定植于皮肤、胃肠道、呼吸道和泌尿生殖系统等。
    白色念珠菌是最常见的与口腔生物膜形成相关的机会性致病微生物,以芽生孢子和假菌丝的形式存在,假菌丝是孢子大量繁殖的致病形式。在健康人体内,白色念珠菌可常驻于人体中,不会引起重大疾病。但在机体免疫低下时,白色念珠菌定植可能成为一种机会性病原体,引起口腔黏膜甚至全身系统性感染。
    目前研究表明,Hst5可有效对抗白色念珠菌感染。对Hst5不同残基片段抗白色念珠菌能力的研究发现,由12个氨基酸残基组成的片段P-113是Hst5发挥生物学功能的最短片段。研究表明,Hst5抑制白色念珠菌菌株生长浓度为25~800μg/mL,最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为8~16μg/mL。
    唾液Hst5的另一特点是具有保护口腔上皮免受白色念珠菌感染的能力,这在牙龈成纤维细胞的体外研究中得到了证实。该研究发现,Hst5预先孵育口腔上皮可显著减少白色念珠菌引起的口腔上皮细胞凋亡;当Hst5吸附于口腔上皮时,白色念珠菌假菌丝形成受到抑制。
    Moffa等研究发现,当Hst5与淀粉酶共同作用时,与单独使用Hst5相比,其抗真菌作用减弱。这也表明,Hst5在口腔中具有抗真菌作用,但与其他唾液蛋白共同作用时,其抗真菌作用可能减弱。这可能是唾液蛋白之间存在拮抗作用,降低了Hst5的抗真菌活性。Pusateri等[和Konopka等研究表明,Hst5不仅对浮游状态的白色念珠菌具有抑制作用,还能够抑制白色念珠菌生物膜的形成。
    Vukosavljevic等通过体外实验发现,当Hst5吸附在聚甲基丙烯酸甲酯或羟基磷灰石上30、90和1440min时,可减少白色念珠菌的定植数量。其作用方式可能为Hst5通过显著减少白色念珠菌假菌丝的定植,进而阻止微生物群落进一步聚集和生长来实现的。Hst5是所有Hst家族成员中抗真菌活性最强的,但其作用方式和具体机制一直是学者们争论的焦点。虽然,Hst5在到达其靶点之前必须先与真菌细胞壁相互作用,并穿过细胞壁以诱导毒性;但是,其与细胞壁和细胞膜的相互作用模式存在争议。
    Hst5对耐氟康唑和两性霉素的菌株有效,因此推测其抗真菌机制不同于唑类和两性霉素。Li等的研究结果显示,念珠菌表面存在热休克蛋白Ssa1p和Ssa2p,Hst5可使Ssa1p或Ssa2p的单突变株灭活率由80%降至50%~60%,将双突变株灭活率降至20%~30%,从而推断Hst5与念珠菌表面的热休克蛋白Ssa1p和Ssa2p结合,作用于特定靶器官,造成细胞死亡。
    此外,Helmerhorst等报道,Hst5引起细胞死亡的原因并不局限于直接的细胞膜效应,其抗真菌活性与活性氧(reactive oxygen species,ROS)的形成有关,具体机制为:真菌细胞膜通过膜受体或膜电位摄取Hst5,进入胞内后作用于线粒体,在辅酶Q水平上抑制线粒体呼吸并产生ROS,引起生物大分子氧化和细胞完整性丧失,最终导致细胞死亡。由此可见,线粒体是Hst5对抗白色念珠菌的靶点,呼吸活动的紊乱导致ROS的形成,是细胞死亡的原因。
    部分关于Hst5的机制研究还表明,Hst5不是一个单一靶点,而是多个胞内靶点协同作用,通过钾离子的丢失导致渗透不平衡,触发杀灭真菌的活性。Hst5的抗真菌活性受环境因素的影响,如pH值、离子浓度、营养成分等,而口腔的微环境是Hst5发挥抗菌活性的合适场所。
    2.慢性牙周炎
    2.1抑制牙周致病菌的定植与共聚
    慢性牙周炎(chronic periodontitis)是一种慢性炎症性疾病,其特征是骨吸收、牙齿附着丧失和牙周袋的形成。慢性牙周炎的主要病因是病原微生物在牙周袋内定植,造成局部共生菌群失调,在与宿主免疫防御系统的相互作用中,导致牙周支持组织的炎症性病变发生。
    牙周致病菌在生物膜中生长的能力是重要的致病因素之一,也是被广泛研究的特性。封闭在生物膜结构中的细菌能够抵抗宿主免疫系统和抗菌剂的攻击,从而导致持续性感染。因此,抑制生物膜的形成有助于致病菌的清除。
    慢性牙周炎与龈下菌斑中的革兰阴性厌氧菌密切相关,特别是牙龈卟啉单胞菌、福赛坦菌(Tannerella forsythia)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)。其中,牙龈卟啉单胞菌是一种革兰阴性厌氧菌,为无芽胞的球杆菌,是慢性牙周炎的主要致病菌之一。它可定植于口腔,具有黏附性,能够与上皮细胞、口腔生物膜和革兰阳性菌共聚。
    Murakami等通过实验发现,唾液Hst5和Hst8对牙龈卟啉单胞菌与轻型链球菌(Streptococcusmitis)的共聚集有明显的抑制作用,含有组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)残基的阳离子肽可与牙龈卟啉单胞菌特异性结合。此外,Hst5可抑制龈上菌斑中具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)与牙龈卟啉单胞菌的共聚和生物膜的形成,这个过程是通过影响具核梭杆菌FomA基因及牙龈卟啉单胞菌血凝素基因表达实现的。
    Borgwardt等研究发现,牙龈卟啉单胞菌血凝素B上存在2个与Hst5结合的位点,生理浓度的Hst5可与牙龈卟啉单胞菌血凝素B结合,并且这种结合是快速、可逆、饱和及特异性的。血凝素B作为牙龈卟啉单胞菌的主要毒力因子,参与微生物对宿主细胞的非菌毛黏附。Hst5与牙龈卟啉单胞菌血凝素B结合后,可减弱血凝素B诱导的人骨髓树突状细胞趋化因子反应。
    与红细胞的结合对牙龈卟啉单胞菌等细菌非常重要,因为红细胞内的氧化血红素是重要的营养因子,Hst5可通过抑制牙龈卟啉单胞菌的血凝作用来干扰其生长。而牙龈卟啉单胞菌摄取血红素的能力也直接影响细菌的生长和共聚。上述研究结果表明,Hst5可以抑制牙周致病菌尤其是牙龈卟啉单胞菌在口腔内的黏附与定植,并可能是通过干扰血凝素基因的表达完成的。
    2.2抑制蛋白酶及中和脂多糖
    宿主来源的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)被认为是细胞外基质降解的关键起始因子,是细胞外基质正常周转的主要酶类之一。MMPs和细菌蛋白酶的失调与牙周炎的发生有关,而Hst5对宿主和细菌分泌的蛋白酶活性具有很强的抑制作用。
    Gusman等研究发现,Hst5能够抑制宿主MMP-2和MMP-9的活性,其50%的抑制浓度分别为0.57μmol/L和0.25μmol/L。此外,牙龈卟啉单胞菌分泌的胰酶样蛋白酶是其重要的毒力因子,能够降解胶原纤维和免疫球蛋白,参与细胞外基质和牙周结缔组织的破坏,而Hst5可特异性地抑制胰酶样蛋白酶的分泌。
    以上研究结果均提示,Hst5能够通过抑制参与牙周组织破坏的宿主酶和细菌酶,来减少蛋白酶引起的细胞外基质降解,在维护牙周组织健康中发挥重要作用。牙龈卟啉单胞菌的脂多糖是细胞外膜的主要成分,是牙龈卟啉单胞菌的毒力因子之一,可诱导巨噬细胞分泌炎性细胞因子白介素(interleukin,IL)-6和IL-8。相关研究表明,Hst5能够中和脂多糖,抑制人牙龈成纤维细胞对IL-6和IL-8的诱导,显著减弱其趋化反应,通过调节宿主的炎症反应来维持口腔稳态。
    3.龋病
    龋病是以细菌为主要病原体,多种因素作用下,发生在牙体硬组织的慢性、进行性、破坏性的口腔疾病。目前临床研究显示,唾液Hst5浓度高低和龋病的严重程度相关,认为Hst5可应用于龋病的预防和治疗,特别是在儿童龋病中。Munther研究表明,无龋儿童唾液中Hst5的浓度显著高于患龋儿童,且随着龋病严重程度的增加,Hst5的浓度逐渐降低。
    变异链球菌是人类主要的致龋菌之一,其在牙菌斑生物膜中的过度增殖,是龋病发生发展的重要原因。Hst5主要是通过抑制变异链球菌生长及菌斑生物膜的形成来预防龋病的发生。Krzysciak等研究发现,Hst5具有抑制变异链球菌体外生长和形成牙菌斑生物膜的能力。质量浓度为27.2μg/mL的Hst5在体外表现出抑制和杀灭变异链球菌的作用,无论是单独使用还是与溶菌酶混合使用时,均能抑制变异链球菌的生长。
    Huo等通过采用Hst5有效抗菌片段P-113作用于变异链球菌的生长过程,得出了与Krzysciak等相似的结论。P-113与变异链球菌共培养10h后,明显表现出对变异链球菌生长的抑制作用,MIC为27.29μmol/L,而不加入P-113的菌株在整个培养时间内表现出持续增长的趋势。而且,变异链球菌与P-113共培养过程中,未检测到裂解的细菌细胞,从而推测Hst5在不破坏胞膜完整性的情况下诱导了变异链球菌活性的改变。
    Fernández-Presas等采用透射电镜对变异链球菌进行超微结构观察,发现Hst5可以穿透细胞壁和细胞膜,在细胞内积累并与DNA相互作用,引起细胞死亡。Hst5除对浮游状态下的变异链球菌具有抑制和杀灭作用,还可以抑制变异链球菌生物膜的形成,抑制变异链球菌细胞与其他种类的生物菌群共聚,从而减少变异链球菌在牙齿和牙龈表面的黏附。此外,Hst5作为获得性膜(acquired enamel pellicle,AEP)的组成之一,可以通过静电吸引吸附在牙釉质表面,有效抑制牙釉质脱矿,并在一定程度上抵抗细菌产酸引起的牙齿损伤。
    Vukosavljevic等测量了Hst5与羟基磷灰石表面之间的黏附力,发现Hst5对羟基磷灰石表面的黏附力强于白蛋白。这可能有助于抑制口腔微生物聚集定植于口腔硬组织表面,并发挥抗菌作用。虽然,Hst5减少羟基磷灰石溶解的确切机制尚不清楚;但是,这些研究提示Hst5可在预防龋病方面发挥一定作用。
    4.小结
    唾液Hst5与口腔念珠菌病、牙周病、龋病等口腔疾病具有相关性,但确切的分子机制目前还不是十分清楚。唾液Hst5对白色念珠菌具有很强的抗菌活性,它与其他抗真菌药物作用机制不同,具有预防或治疗耐药真菌感染的潜力。同时,Hst5在维护牙周组织健康方面也发挥着重要作用,其主要通过抑制和杀灭牙周致病菌,调节宿主和细菌产生的对牙周组织具有破坏作用的酶类等发挥作用;但Hst5与牙周疾病发生发展关系的研究目前尚未获得明确结论,有待进一步深入研究。
    Hst5主要通过抑制变异链球菌生长和形成牙菌斑生物膜的能力来减少龋病的发生。研究Hst5在口腔疾病中的作用具有重要意义,仍需大量深入研究,进一步探索Hst5在口腔内的生物学作用及分子机制,为Hst5应用于口腔疾病提供新思路。
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