经过完善根管治疗的患牙虽然可延长其在口腔内的存留时间，但由于其失去了牙髓的营养，缺乏血供和感觉功能，跟健康牙相比更容易缺失。因此，牙髓再生已在全世界范围内得到越来越广泛的关注，实现牙髓再生或将成为治疗牙髓根尖周病的优先考虑方案。
目前，学者们一直致力于用组织工程的方法，即借助生物支架材料、细胞因子及干细胞等要素通过再植技术或归巢技术实现牙髓组织的再生和功能重建。而可预见的及可靠的干细胞定向分化是组织工程技术应用的核心，细胞因子缓释系统通常被用于体内干细胞的定向分化。然而近期在临床应用中发现，一些细胞因子已在体内引起了不良反应，如骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）在体内可引起异位骨生成、破骨细胞介导的骨吸收及不可预期的脂肪形成等。因此，学者们开始寻找一种替代细胞因子及其复杂缓释机制的新方式来再生组织。细胞自身来源的外泌体（exosomes）因其独特的优势受到关注。
外泌体是由细胞分泌的脂质双分子层结构的微小囊泡，直径为30～150 nm，携带DNA、蛋白质和miRNA等分子。当外泌体和靶细胞接触后，其携带的生物分子经胞吞的形式被接收并发挥细胞间信息交流的作用。同时，外泌体具有低免疫原性和无细胞毒性等优势，使其成为组织修复再生等领域的新选择。
目前，大部分组织再生和修复中，外泌体是通过重复给药或局部注射的方式直接进入缺损位点，但是这些方式可能导致外泌体剂量过大或在体内快速地被清除，不能达到组织再生的持续性有效浓度。因此，将外泌体包裹或结合到生物支架中实现有序缓慢释放已成为再生医学治疗的新策略。
合适的生物支架材料所具有的三维结构和相互连通的孔隙可容纳外泌体的嵌入，维持外泌体中蛋白质和miRNA等分子的完整性。随着支架材料的不断降解，外泌体被持续释放，吸引并诱导干细胞迁移和分化，最终形成目标组织。目前研究发现，干细胞来源的外泌体可促进牙髓再生，且将其包裹在生物支架中实现缓释可更好地促进牙髓再生。本文就外泌体在牙髓再生中的作用，以及生物支架搭载外泌体在牙髓再生中应用的研究进展做一综述，重点讨论生物支架控释外泌体在牙髓再生领域中的应用、挑战和前景。
1.外泌体在牙髓再生中应用的优势
近年来，在牙髓再生领域中，外泌体已被证实可以有效促进牙髓牙本质复合体的再生。但不同细胞来源的外泌体其生物学特性及功能不同。研究表明，间充质组织来源的外泌体可以诱导表皮细胞产生基底膜样的复合物（釉原蛋白和成釉蛋白）；表皮来源的外泌体可以促进间充质细胞的成牙分化和矿化；牙龈来源的外泌体可以促进施万细胞（Schwann,SCs）的增殖和迁移，通过调控相关基因的表达促进了神经的再生；牙髓细胞来源的外泌体能促进牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）的成牙分化及牙髓样组织的再生，其在血管内皮细胞引导的血管再生方面同样具有重要作用。
Huang等研究发现，培养在成牙分化条件培养基中的DPSCs分泌的外泌体（DPSCsExo），可显著促进DPSCs的成牙分化，使得成牙分化相关基因牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）、RUNT相关转录因子2（recombinant runt related transcription factor,Runx2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ，COL1）的表达明显上调，并发现P38MAPK通路参与介导了DPSCs的成牙分化。
在另一项研究中发现，经过脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）预处理的DPSCs-Exo可促进SCs的增殖、迁移和分化，并且观察到DSPP的表达和矿化结节的形成，这对牙髓神经的再生具有指导意义。
血管形成在牙髓再生过程中十分重要，Huang等将LPS处理的DPSCs-Exo刺激人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HU-VECs）发现，DPSCs-Exo通过促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）分泌促进了HUVECs的增殖和分化，基因测序结果发现其过程中涉及多个与血管形成相关的miRNA和分子通路；在相似的研究中，Xian等证实DPSCsExo能够增加VEGF的分泌，且发现通过抑制P38MAPK信号通路，促进了HUVECs的增殖和分化，增强了血管形成能力。
此外，Lin等研究发现，根尖牙乳头干细胞（stem cells from the apical papilla,SCAP）内吞SCAP-Exo后，miR-126表达上调，抑制相关负调节因子SPRED1并激活了ERK信号通路，最终促进了血管再生。将SCAP-Exo注射入离体牙根管内，可观察到根管内牙髓样组织的生成，在原有根管壁上发现有牙本质样组织的新生，其中成牙分化相关基因DSPP及其蛋白表达升高，且矿化结节的形成显着增加。这表明SCAP-Exo可有效促进血管及牙本质样组织再生。
Wu等研究发现，脱落乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED）聚合体分泌的外泌体可促进HUVECs的分化，并发现外泌体通过miR-26a调节TGF-β/SMAD2/3信号通路，改善了血管生成能力。在进一步的研究中，张青将SHED聚合体来源的外泌体植入小型猪原位牙髓再生模型中，组织切片结果发现髓腔内形成新生的牙髓样组织，组织中可见粗大的主血管，周围有大量毛细血管生成，其中可见神经样组织新生。
以上的研究结果证实，不同牙源性干细胞来源的外泌体均可通过调控干细胞的增殖、迁移和分化，来促进牙髓血管和神经的生成，以及牙本质样组织的形成，进而生成了较理想的牙髓牙本质复合体。外泌体的出现及其较为成熟的应用成为了在牙髓再生领域中的理想策略和方法。
2.生物支架搭载外泌体在牙髓再生中的应用
2.1 生物支架搭载外泌体的优势
外泌体在组织的修复和再生等方面拥有巨大的潜力，在牙髓再生中的应用也具有广阔前景，但单独存在的外泌体无法克服在体内大量且快速流失的问题。生物支架作为一种可控的释放平台，将外泌体包封在表面微孔中，实现了外泌体的固定支撑并保护其减少流失。
支架通过自身由外到内的降解来缓慢释放外泌体，保证外泌体能持续不断地与内源性干细胞接触，促使未分化的间充质干细胞分化成为特定的细胞；miRNA、遗传信息等同时被传递，在此过程中生物支架持续降解，组织不断新生，该过程达到动态平衡，最终完成组织的再生。
理想的缓释外泌体的生物支架材料应具有以下特点：（1）为外泌体提供支撑并减少流失，且保持其活性和结构的完整性；（2）能够持续释放外泌体并辅助调节周围细胞表型变化及分化；（3）为细胞生长提供三维微环境，保证细胞能不断与外泌体接触，实现其有效分化。
2.2 搭载外泌体的生物支架的种类及特点
目前应用在组织再生领域的生物支架主要分为天然支架、合成支架及复合支架。天然支架有良好的生物相容性和生物可降解性且较易获得，主要有壳聚糖、胶原蛋白和细胞外基质等。壳聚糖水凝胶已被证明是一种搭载外泌体的理想材料，其具有良好的生物降解性、生物相容性、溶胀度及较小机械阻力等特点。
研究发现，壳聚糖水凝胶能够通过支架自身的降解使外泌体持续释放，促进牙槽骨再生和牙周上皮的恢复，缓解牙周炎症；在另一项研究中，壳聚糖水凝胶缓释人胎盘来源的间充质干细胞分泌的外泌体，延长了外泌体在损伤部位的停留时间，并保护其不被免疫系统清除，增强了外泌体在体内的治疗效果。
胶原蛋白具有良好的生物活性，其形成的高度多孔的结构可充分释放外泌体。学者们利用外泌体可通过血脑屏障（blood brain barrier,BBB）的特点，将多孔胶原蛋白支架搭载外泌体穿通BBB进行靶向治疗，改善了外伤性脑损伤的预后。但上述支架材料存在降解过快、不稳定及强度较低等问题。
合成支架解决了天然支架存在的降解过快、强度较低等问题，其机械性能、黏度、孔隙率和降解率可人为调控，主要包括聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸-乙醇酸（PLGA）、生物陶瓷、生物活性玻璃等。有学者设计了一款PLGA和聚乙二醇（PEG）组成的共聚物微球，该支架具有良好的力学性能，其纳米纤维表面和多孔的内部结构可有效增加细胞增殖和蛋白质的吸附，并通过不断降解将所包裹的外泌体从外向内不断释放，有效促进了骨缺损部位的新骨形成。
生物活性玻璃支架是一种生物相容性较好的材料，具有多孔结构、良好的亲水性和力学性能。在一项研究中，通过生物活性玻璃支架包裹外泌体，在支架表面微孔中实现了外泌体生物活性的维持和缓释，在大鼠颅骨缺损模型中快速且高质量地诱导了骨再生。
但合成支架材料在体内的降解速率较慢，且不易塑形，无法满足不规则组织的要求。此外，外泌体结合生物支架的运用不仅在组织修复再生等方面取得了显著进展，而且对于系统性疾病的治疗也有良好的效果。
3D石墨烯纳米支架能够穿过BBB进入神经中枢系统，被认为是神经学发展中非常有前景的材料，其3D结构更有利于神经元电路的调节。在阿尔兹海默症（Alzheimer′s disease,AD）中，3D石墨烯纳米支架通过缓慢释放外泌体及特定的功能性生物分子，可使受体细胞改善病理状态，但该合成支架的神经毒性也成为了潜在问题。
复合支架是将不同材料按照其优缺点自由组合在一起形成的支架，能够在各自的优势和劣势之间达到平衡，取得整体改进。例如：缺乏足够硬度的聚合物可与硬度更高的材料（如陶瓷）相结合，以克服其固有的特性，使之适合于牙体组织再生。液晶材料由于其可调的物理性质和良好的黏弹性在骨再生医学生物材料中备受青睐。
Zhan等设计了一种新型复合液晶/丙交脂支架，发现比纯丙交脂支架有更优越的矿化能力和更好的组织相容性，有利于细胞增殖和分化及血管生成。羟基磷灰石目前作为具有良好诱导骨再生能力的移植材料，结合PLGA组成了复合支架，与软骨细胞来源外泌体结合修复了关节软骨病损，发现其具有更好的骨结合能力，可以抑制软骨的退变并重建软骨，最终取得良好的疗效。
2.3 生物支架搭载外泌体促进牙髓再生
目前在牙髓再生领域中，与外泌体结合的生物支架材料主要集中在水凝胶支架方面，因为牙髓腔自身狭小且形态不规则，符合其形态要求的支架材料相对较少；此外，传统的可注射型微球支架可能产生大量降解副产物，缺乏仿生表面结构，无法与细胞进行良好的交流。水凝胶中含有大量的水，降解性能较好，且可为细胞生长提供足够多的输送营养途径，具有和天然组织非常相似的生物物理学特性，十分贴合原位牙髓牙本质再生的条件，受到了更多学者的青睐。
目前应用在牙髓再生领域中的水凝胶大多属于天然来源，其较合成类水凝胶在生物降解性能等方面具有良好的优势。蓝彬园等将LPS处理的DPSCs-Exo包封在多肽水凝胶中并移植在裸鼠皮下，发现牙髓样组织的生成，矿化组织沿根管壁纵向排列，胶原纤维排列整齐，新生血管较多。但也有研究发现外泌体单纯包裹在水凝胶内容易出现爆释现象，即在刚注射入根管内时外泌体被大量释放。
该问题可通过调整水凝胶的结构及化学性质而改善，如通过改善水凝胶本身多孔结构及调节其机械性能来降低水凝胶材料本身的降解速率；也可通过RGD肽等自由基团对水凝胶进行化学改性，改善其对外泌体的包裹性能等，从而控制外泌体的缓慢释放，实现牙髓牙本质复合体再生。
乔新通过纤维蛋白/明胶水凝胶包封DPSCs-Exo来控制其释放，发现随着明胶的逐步吸收，DPSCs-Exo被缓慢释放，促进干细胞的迁移分化及血管形成，最终生成牙髓样组织。在另一项研究中，胶原蛋白水凝胶支架通过缓释上皮根鞘细胞来源的外泌体，促进了牙乳头细胞的成牙分化和血管形成，最终形成牙髓样组织。此外，有研究表明外泌体胞膜表面有Ⅰ型胶原和细胞黏连蛋白的结合位点，而这种结合位点能更好地与水凝胶内部的胶原或修饰后的结构结合，实现其在水凝胶内部包裹并缓慢释放的目的。
除了水凝胶以外，Swanson等设计了一种PEG-PLGA高分子共聚物微球，通过自组装有效地包裹了DPSCs-Exo。在PEG-PLGA微球缓释系统中有多个内部微球，其中均包含大量外泌体，在生物降解过程中通过从外到内的降解来释放外泌体，有效解决了外泌体的爆释问题。
在该支架系统中，由于PLGA共聚物材料具有疏水性强、密度大及水渗透较慢的特点，微球降解较慢从而使外泌体能够缓慢地进行释放，而其中包含的足够浓度海藻糖材料可能会限制外泌体的聚集，使外泌体释放更加均匀，实现有序且缓慢释放。但PLGA较慢的生物降解速率和大量副产物的产生也成为进一步需要解决的问题。
在其他领域中，Wu等开发了一种超分子水凝胶，可以通过外界刺激实现按需释放，该材料由于结合氢键等被赋予了良好的机械性能，且通过外界相关刺激诱导释放的开关，从而实现按需释放；Gong等设计制造了一款热控水凝胶，通过温和的热刺激来实现按需释放，克服外泌体早期爆释的问题。这为我们在牙髓再生中生物支架材料的设计提供了的新思路。
3.结语
近年来，大量研究表明外泌体具有促进组织修复再生等能力；而且相较于干细胞，外泌体无免疫排斥反应及细胞毒性等副反应。在牙髓再生领域中，外泌体可有效调节细胞的增殖、迁移和分化，促进血管和神经的生成，从而实现牙髓牙本质复合体的再生。而生物支架材料可与外泌体有效结合，并将外泌体稳定包裹在孔隙微结构中；随着材料的降解，外泌体被不断释放，持续地刺激内源性细胞迁移，并引导其分化，以诱导牙髓组织再生。这种缓释方式将增强外泌体促进牙髓组织再生的效果。
虽然学者们通过调整生物支架的孔隙大小、强度并结合不同自由基团等方法解决了外泌体爆释的问题，但仍有一些问题尚待解决。例如：在牙髓再生过程中，外泌体的释放应随着组织再生的过程有所调整，早期的快速释放和后期的持续性释放相结合，且释放的量也需要精准调控，这就需要进一步调整支架的内部结构以适应组织再生的要求；其次，不同的生物材料具备各自的优势，如何将他们的优势进行组合以更好地促进组织新生也尚需探究。相信通过不断探索对生物支架性能的调节和优化方法，使其更好地符合牙髓再生中外泌体缓释的条件，以实现理想的牙髓样组织再生。
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