［摘要］　目的　探讨化疗药物顺铂(CDDP)对口腔鳞癌细胞凋亡及细胞周期特异性的诱导作用。方法　选用人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113为研究对象,应用倒置显微镜、荧光显微镜、透射电镜、流式细胞仪等方法进行观察。结果　CDDP作用Tca8113细胞后，细胞增殖变慢，增殖指数下降；细胞变小、变圆，失去贴壁性，从附着处脱落。DNA染色后荧光显微镜下观察，细胞核呈现橙红色、半月形、不规则块状等凋亡形态变化。透射电镜观察，细胞固缩，染色质浓聚边缘化，凋亡小体形成；流式细胞仪测定显示细胞周期发生明显改变，细胞分裂阻滞在S期。结论　CDDP能诱导Tca8113细胞凋亡，其作用有时间依赖性；诱导细胞凋亡可能是CDDP抗口腔鳞癌的一个重要机制。
［关键词］　癌; 舌; 鳞状细胞; 顺铂; 凋亡

　　恶性肿瘤的化学治疗已有50多年的历史，但有关化疗药物作用于肿瘤细胞的确切机制至今尚未完全阐明。近年来的研究发现，大多数化学药物主要是通过诱导细胞凋亡(apoptosis)而实现其抗肿瘤作用。本文通过观察细胞毒化疗药物顺铂（CDDP）对Tca8113细胞凋亡诱导作用与增殖周期的影响，探讨CDDP抗口腔鳞癌的作用机制，为临床选择化疗方案提供参考依据。

1　材料与方法

1.1　细胞培养和生长观察
取对数生长期的Tca8113细胞接种于25ml培养瓶中，分为对照组和药物处理组。培养液为PRMI-1640培养基(GIBCO)，含10%小牛血清，青、链霉素各200U/ml。处理组细胞加入CDDP (齐鲁制药厂生产)，浓度分别为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml；置5% CO2培养箱中培养，每24h取不同时间培养的细胞于倒置显微镜下(Nikon)观察、拍照。
1.2　细胞Giemsa染色观察
　　取CDDP(3μg/ml)处理组细胞，按文献［1］方法进行染色和光镜观察。
1.3　透射电镜观察
　　分别收集对照组、CDDP 1μg/ml、2μg/ml作用3d细胞，3%戊二醛4℃固定2h以上； 1%锇酸4℃固定2h；双蒸水冲洗3次；30%、50%、70%和90%丙酮4℃各10min，100%丙酮室温3次，每次15min。样品于包埋液中(环氧树脂618)室温浸透过夜，60℃聚合48h。伊红-甲苯胺蓝染色光镜观察定位，于Reichert-Jung超薄切片机超切70-90nm，经醋酸铀和枸椽酸铅双重电子染色，透射电子显微镜下(日立H-600)观察、拍片。
1.4　细胞荧光染色凋亡观察
　　收集对照组及CDDP 3μg/ml作用2、4、6d细胞，按文献［2］进行DNA染色。荧光显微镜下观察200只细胞，计数、照像。判断标准：凋亡细胞核染成红色且固缩成片块状，坏死细胞整个染成均匀红色，活细胞为绿色。
1.5　流式细胞仪检测
　　收集对照组及CDDP(3μg/ml)细胞，用PBS洗1次，加1.5ml PBS悬液，边摇边加无水乙醇(置冰格)0.5ml后加2ml，最终浓度70%。调整细胞密度1×106/ml，离心去掉上清液，加1800μl A溶液(胰酶消化液)充分作用，加1500μl B溶液(胰酶抑制酶液RNASE)10min，加1500μl C溶液(PI-碘化丙啶)作用15min以上， 200目尼龙网过滤，上机(FCM)作DNA细胞周期采样分析。
1.6　实验数据统计处理
　　每实验重复3次，均数间比较采用t检测，P＜0.05为显著性水平。

2　结果

　　光镜下观察，Tca8113细胞经顺铂 (浓度为3μg/ml)作用后细胞增殖速度减缓， 增殖指数下降；胞质粗糙，内有颗粒堆积；细胞变小、变圆，失去粘附力，从附着处脱落。Giemsa染色镜下见部分细胞体积缩小，染色质浓染呈碎块状(图1)。细胞DNA染色荧光显微镜观察，CDDP(3μg/ml)作用后可见部分细胞核固缩，被染成橙红色即凋亡细胞，其余细胞为绿色(活细胞)(图2)。浆、核均为红色的坏死细胞极少见。随着时间延长，凋亡细胞比例上升(表1)。透射电镜观察细胞固缩，染色质浓聚、成块状边缘化，可见凋亡小体形成(图3)。电镜下观察计数，100只细胞(CDDP 1μg/ml组)中有11只凋亡，而CDDP 2μg/ml组，100只细胞有16只凋亡细胞；对照组100只细胞中仅发现2只凋亡。流式细胞仪检测结果表明，DDP(3μg/ml)作用Tca8113细胞72h后，细胞周期发生明显变化(表2，3)，表现为G0/G1期细胞比例下降，S期细胞比例升高，提示CDDP作用后,细胞被阻滞在S期。

责任编辑：姚红祥