小分子化合物促进牙髓牙本质复合体损伤修复的研究进展

    牙髓牙本质复合体具有免疫防御和修复功能，细菌感染、持续炎症、患者年龄、系统性疾病等因素均有可能影响牙髓牙本质复合体的损伤修复。目前临床上活髓保存材料以无机材料为主。研究发现，生物活性分子也可通过与细胞表面受体或细胞内功能蛋白直接作用，促进组织损伤修复。小分子化合物作为生物活性分子的一种，有望成为生长因子类盖髓药物的替代品，具有较高临床应用价值。本文将就各类小分子化合物在促进牙髓牙本质复合体损伤修复的作用机制进行综述。
    1.小分子化合物简介
    生物活性分子根据分子量和作用方式，可分为生物大分子(蛋白/多肽、抗体、核酸等)和小分子化合物两大类。生物大分子的分子量通常远大于1 000 u，通过与细胞膜表面受体结合，激活特定下游信号通路，促进牙髓牙本质复合体损伤修复。但生物大分子存在价格昂贵、有免疫原性、高剂量引发不良反应等问题。
    小分子化合物分子量一般小于1 000 u，通常由几十个原子组成，可直接进入细胞膜，不与基因组整合。小分子化合物可与细胞内外特定蛋白作用位点直接结合，改变其活性结构域构象，调控蛋白质功能，进而调控细胞内关键信号通路和代谢途径，促进组织修复再生。在发挥生物活性的同时，小分子化合物还具有无免疫原性、生产成本低等优点。近年来，小分子化合物在颌骨缺损修复、牙菌斑生物膜控制、干燥综合征治疗等领域均有研究。
    2.小分子化合物分类与应用
    根据药物研发方法，应用于牙髓牙本质组织损伤修复的小分子化合物可分为：天然产物提取的小分子化合物、基于靶点设计的小分子化合物和发现新功能的经典小分子化合物。
    2.1 天然产物提取的小分子化合物
    天然产物提取的小分子化合物主要来自动植物。随着质谱(mass spectrum， MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance， NMR)等检测手段的进步，更多小分子化合物从天然产物中成功分离。Bannenberg等基于MS利用蛋白质组学和脂质组学，从小鼠腹膜炎模型的腹膜渗出物中发现一类代谢产物小分子化合物具有促炎症消退功能，定义为促消退介质(specialized pro-resolving mediators， SPMs)。本课题组研究发现，SPMs消退素E1(resolvin E1，RvE1)能有效调控牙髓炎症，促进修复性牙本质形成。黄酮类、异黄酮类、异喹啉生物碱类等多种中药来源的小分子化合物也可抑制牙髓炎症，促进牙髓干细胞分化和修复性牙本质形成。
    2.1.1 黄芩苷
    黄芩苷是中药黄芩的主要活性成分之一，属于黄酮类化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒和抗菌等作用。闫佳等对Beagle犬牙暴露牙髓使用黄芩苷糊剂直接盖髓，玻璃离子充填，发现黄芩苷糊剂盖髓30 d后，83.3%犬牙形成完整牙本质桥，对照组Dycal盖髓后30 d无犬牙形成完整牙本质桥；韩耀伦等也将黄芩苷糊剂用于SD大鼠第一、第二磨牙直接盖髓，结果发现黄芩苷糊剂组大鼠牙髓组织炎症程度显著下降，但黄芩苷浓度均未有精确描述。
    谭为霞在研究中制备了质量浓度为20 μg/mL的黄芩苷海藻酸钠凝胶，用作Beagle犬牙髓暴露后的直接盖髓剂，实验发现黄芩苷海藻酸钠凝胶联合矿物质三氧化物凝聚体(mineral trioxide aggregate， MTA)盖髓7 d后，牙髓组织内TNF-α阳性细胞的数量显著低于单纯MTA盖髓组。
    薛晶等细胞研究表明，20 μmol/L黄芩苷可抑制炎症牙髓干细胞的炎症因子分泌，促进Runx2、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein， DSP)、OSX、骨桥蛋白(osteopontin， OPN)、骨钙素(osteocalcin， OCN)等蛋白表达，抑制NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路。而Lee等的研究则提示黄芩苷的水解苷元黄芩素可能通过激活骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)和Wnt/β-catenin经典信号通路促进人牙髓细胞分化为成牙本质细胞。
    2.1.2 染料木黄酮
    染料木黄酮又称金雀异黄酮、染料木素，存在于豆类作物和淡豆豉、杜仲、葛根、鸡血藤、山豆根等中草药中，属于异黄酮类化合物。研究表明，染料木黄酮在炎症、肿瘤、肥胖、糖尿病、心血管疾病、阿尔茨海默病、骨质疏松等疾病中均发挥保护作用。
    Hayashi等将染料木黄酮用于Wister大鼠牙齿直接盖髓实验，染料木黄酮组较氢氧化钙组修复性牙本质形成率高，牙髓炎症程度更低。细胞实验发现1 μmol/L染料木黄酮可显著上调大鼠牙髓细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活性、促进矿化结节形成，牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein， DSPP)和牙本质基质磷蛋白1(dentin matrix protein-1，DMP-1)mRNA水平及OCN蛋白水平显著升高。
    进一步机制研究发现，染料木黄酮可能通过调控干细胞分化、细胞外基质形成等方式促进修复性牙本质的形成。Dai等利用包含96个骨形成相关基因的人类成骨基因阵列GEArray Q，对体外矿化诱导培养人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells， hBMSCs)进行表达谱分析实验发现，染料木黄酮可促进矿化过程中22个促成骨基因的表达，其中包括转录因子Runx2、信号分子BMP2、细胞外基质Ⅰ型胶原α1链(collagen type I alpha 1 chain， COL1A1)等基因。
    2.1.3 小檗碱
    小檗碱又称黄连素是来源于黄连等中药的季铵型生物碱，属于异喹啉类，具有抗菌、抗炎、抗氧化、调节膜电位、调节血糖和心率等作用，能治疗消化道疾病、糖尿病、心律失常等。
    Cui等在4周龄Wistar大鼠的第一磨牙构建根尖周炎模型，模拟年轻恒牙根尖周炎，分别用2 mg/mL黄连素或氢氧化钙糊剂充填根管3周。结果发现，黄连素组根管壁更厚、根尖直径更小、牙根更长。经转录组测序分析发现，1 μg/mL黄连素可能通过上调人根尖乳头干细胞(human stem cells from apical papilla， hSCAPs)Ctnnb1和Runx2基因表达，促进hSCAPs干细胞分化，提示黄连素可能通过促进干细胞分化等方式促进牙髓牙本质复合体的再生和修复。
    徐爱凤等制备黄连素复合生物膜用于小型猪牙齿直接盖髓，氢氧化钙作为对照组，结果发现，与对照组相比，黄连素复合生物膜组的穿髓孔处在术后2周时形成的矿化物团块更多，4周后形成的牙本质桥更连续，12周后形成的完整牙本质桥更厚。
    研究发现，1～3 μmol/L黄连素溶液可上调人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells， hDPSCs)矿化诱导过程中的ALP活性及OSX、Runx2、OCN、OPN、DSPP mRNA水平。黄连素可能通过激活EGFR-MAPK-Runx2信号通路促进hDPSCs分化，进而促进修复性牙本质形成。
    2.1.4 RvE1
    RvE1是一种二十碳五烯酸(EPA)衍生物，最初由Serhan等发现并报道，通过与趋化因子配体23(chemerin receptor 23，ChemR23)特异性结合发挥作用。ChemR23是一种G蛋白偶联受体，因此RvE1也是一种受体激活剂小分子。
    RvE1在促进牙髓牙本质复合体损伤修复过程中发挥重要作用。实验发现，50 ng RvE1作用于SD大鼠暴露的炎症牙髓，可显著减少炎症细胞浸润。10 nmol/L RvE1可能通过上调烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide， NAD)依赖性去乙酰化酶Sirt7，同时抑制NF-κB信号通路关键分子磷酸化p65入核和转录活性，降低牙髓成纤维细胞的炎症因子表达，进而抑制牙髓炎症。此外，RvE1显著上调hDPSCs矿化诱导过程中的ALP活性以及DMP1、DSPP和骨涎蛋白(bone sialoprotein， BSP)mRNA水平，提示RvE1可能参与调控干细胞分化为成牙本质细胞的过程。
    2.2 基于靶点设计的小分子
    随着分子生物学和高通量筛选等技术的发展，一系列具有生物学作用的靶点相继被发现。常见的小分子化合物靶点包括各类蛋白质酶、受体、离子通道等。在牙髓牙本质复合体损伤修复的研究中，糖原合成激酶3β(Glycogen synthase kinase 3 beta， GSK3β)是目前主要研究靶点。
    研究发现，以GSK3β作为靶点设计合成的抑制剂对修复性牙本质形成具有显著促进作用。GSK3β是一种保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，通过磷酸化多种功能蛋白和结构蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基，调节细胞内的糖原代谢、Wnt/β-catenin信号转导、G蛋白偶联信号转导等多个重要的生物学过程。胰腺癌、阿尔茨海默病将GSK3β作为重要的药物靶点。GSK3β抑制剂主要通过抑制β-catenin降解，激活Wnt/β-catenin信号通路，参与牙髓牙本质复合体损伤修复过程，通过调控牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化，促进修复性牙本质形成。GSK3β抑制剂分为ATP竞争性和非ATP竞争性两大类。
    2.2.1 CHIR99021
    CHIR99021属于ATP竞争性GSK3β抑制剂，是经组合文库筛选发现的一类氨基嘧啶化合物，对GSK3β分子具有高效特异性，是目前广泛使用的Wnt信号通路激活剂。Neves等实验发现，将5 μmol/L CHIR99021用于CD1野生型小鼠直接盖髓，术后6周形成的修复性牙本质厚度显著高于MTA组，且牙髓组织中Axin2 mRNA升高更显著，提示Wnt/β-catenin经典信号通路激活上调，牙髓干细胞成牙向分化活跃。谢惠兰等研究发现，2 μmol/L CHIR99021可促进人牙髓干细胞成牙本质向分化，Runx2、ALP、OCN、DSPP、Col1mRNA和蛋白水平显著升高。
    2.2.2 杂环噻二唑烷酮(2，4-disubstituted thiadiazolidinones， TDZD)及其衍生物
    2002年，Martinez等首次合成并报道了第一个非ATP竞争性GSK3β抑制剂TDZD，对于抑制GSK3β具有更高的特异性。Tideglusib又称NP12，是TDZD衍生物。在牙髓损伤修复研究中发现，Tideglusib在牙髓暴露和非暴露两种不同程度的损伤状态下，均可促进牙本质的修复。
    在牙髓非暴露损伤模型中，Tideglusib可促进反应性牙本质的形成；在牙髓暴露损伤模型中，Tideglusib直接盖髓处理6周后，组织学染色和microCT均显示修复性牙本质比MTA盖髓处理增加显著，完全充满损伤部位。在Tideglusib盖髓24 h后，牙髓组织的Axin2 mRNA水平显著高于MTA盖髓组。在牙髓细胞矿化实验中，Tideglusib促进矿化结节形成，显著上调DSPP和OCN mRNA水平。
    Alaohali等近来合成了新型TDZD衍生物NP928，并将NP928分别附载于胶原海绵和MA-HA光固化水凝胶，应用于野生型小鼠牙髓牙本质损伤模型中，microCT和Masson染色显示，NP928可显著促进修复性牙本质形成。
    2.3 发现新功能的经典小分子
    随着人工智能在药物设计方面的应用，基于高通量数据，研究者们可以更加迅速便捷地发现经典小分子化合物的潜在新功能。Mundy等在含有3万多种小分子化合物的天然化合物库中筛选出他汀类药物，其可与BMP2启动子特异性结合，并且上调BMP2的转录，进而促进成骨分化与矿化物形成，其中辛伐他汀可促进牙髓牙本质复合体的损伤修复。
    辛伐他汀(simvastatin)是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase， HMGR)抑制剂，可抑制胆固醇合成代谢，临床上用于治疗高脂血症、动脉粥样硬化等疾病。辛伐他汀一方面可能通过诱导BMP2促进修复性牙本质的形成；另一方面可增加血管内皮生长因子的表达，促进血管内皮细胞的增殖和分化，从而促进血管生成。
    有试验将辛伐他汀与α-磷酸三钙或三抗糊剂(100 mg环丙沙星+100 mg甲硝唑+100 mg头孢克肟)混合，应用于患者直接盖髓，结果发现辛伐他汀盖髓组的牙髓炎症反应程度和修复性牙本质形成效果均与MTA盖髓组无明显差异。动物实验进一步证实，负载辛伐他汀的生物材料均可诱导修复性牙本质形成，且厚度和面积显著高于氢氧化钙。辛伐他汀可能通过ERK信号通路促进人牙髓细胞向成牙本质细胞分化；也可能通过增加PI3K和pAKT表达，降低miR-9水平，促进KLF5基因表达，从而促进人牙髓干细胞增殖，但辛伐他汀促进牙髓牙本质复合体损伤修复的详细机制尚未完全阐明。
    3.讨论与展望
    小分子化合物在组织再生领域的应用越来越受到重视，然而在临床实践中仍存在局限。首先，目前临床上对牙髓状态的判断主要通过症状、临床检查和牙髓活力测试等手段，依赖于患者的主观感受，对牙髓炎症状态、组织修复能力缺乏客观判断指标，对症施用相应功能的小分子化合物仍存在困难；其次，目前研究中应用的小分子化合物缺乏针对牙髓牙本质复合体的组织特异性，仍需要更充分的基础研究验证其作用及机制；此外，小分子化合物的局部作用浓度和作用时间仍需进一步研究，以适应组织修复的过程。通过组织工程的方法，利用支架材料和纳米材料构建适当的缓释体系，可以为小分子化合物的临床转化提供可能性。