联合生物材料的牙源性间充质干细胞进行牙周组织再生的研究进展

    牙周炎是一种慢性进行性炎症，病情进展可导致牙周软硬组织的破坏且较难逆转，最终可导致牙齿的松动、脱落。牙周炎治疗的终极目标是实现牙周组织结构(牙骨质、牙周膜、牙槽骨等)及功能的再生。目前再生方式主要为引导性组织再生术(guided tissue regeneration， GTR)或GTR联合骨移植材料(如脱蛋白牛骨基质)，生长因子、釉基质衍生物(enamel matrix derivative， EMD)等其他生物制剂可以单独使用或与GTR、植骨术等联合使用。
    然而这些方法的适应证局限，主要适用于含骨下袋的垂直性骨吸收或者根分叉Ⅰ度和Ⅱ度的患者，且治疗效果受袋壁形态影响很大，对于包含性差的水平型骨吸收及Ⅲ度根分叉病变难以获得理想疗效。GTR和生物制剂能获得一定程度的牙周再生，得益于牙周膜中存留的少量未分化间充质干细胞，但是此类残留的未分化间充质细胞较少，且诱导牙周组织再生的微环境缺失，所以现有临床治疗方式较难实现理想的牙周再生。
    干细胞因其独特的增殖及分化能力受到关注，2004年Seo等从人牙周膜组织中分离、鉴定出牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells， PDLSCs)，开启了牙周再生研究的新时代。组织工程通过细胞、生物材料和(或)生长因子的协同作用诱导功能组织再生，基于干细胞的组织工程技术亦是牙周再生研究的前沿方向，其中牙源性间充质干细胞(dental derived mesenchymal stem cells)是重要的干细胞来源。
    目前牙源性间充质干细胞包括PDLSCs， 牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells， GMSCs)、牙囊干细胞(dental follicle cells， DFCs)、牙髓干细胞(dental pulp stem cells， DPSCs)、人脱落乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth， SHEDs)、牙根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla， SCAPs)。
    以牙源性间充质干细胞为基础的治疗手段可对牙周再生产生积极作用，除干细胞种类外，支架材料是另一个影响牙周再生效果的重要因素，二者联合应用可望成为牙周再生治疗的理想策略。本文将概述现阶段用于搭载牙源性干细胞的生物材料，并对牙源性干细胞联合生物材料在牙周组织结构和功能再生领域的研究进展作综述。
    1.搭载牙源性干细胞的生物材料概述
    目前牙源性干细胞的应用方法主要包括细胞悬液注射、细胞膜片、联合生物材料应用等。单纯干细胞悬液注射具有操作相对简单、创伤小的优势，但悬液固着性差、干细胞难以在注射位点长时间停留。为了提高干细胞的递送效率，研究者们提出了构建干细胞膜片的方式，因细胞膜片除了细胞本身外还包含细胞间基质，为干细胞植入提供了更有利的生长微环境。但一层或数层细胞膜片的厚度有限，且缺乏一定的机械强度。上述两种方式均不能有效填补组织缺损，使用生物材料复合干细胞可在缺损部位提供稳固的细胞生长支撑空间，还可引入生长因子或药物促进细胞的生长和分化。
    根据不同物理、化学、生物组成、特性及层次，可将生物材料分为单相、双相和多相。其中双相和多相指利用两种或多种结构、成分或复合方式来构建不同层次的功能性架构。临床常见的生物材料是以模仿骨组织成分为基础的单相材料，如胶原蛋白、异种骨基质、羟基磷灰石、β-磷酸三钙(β-calcium triphosphate， β-TCP)等，较为单一的成分与结构主要用于实现骨组织的增量，在此基础上的新生组织与天然牙周组织结构上仍存在一定差距。
    因此，基于牙周再生的应用场景，最近的研究聚焦于通过构建双相及多相复合材料来更好地模拟牙周复合结构，即材料设计层次包括牙骨质相、牙周膜相、牙槽骨相中的两项及以上。较多研究以聚己内酯(polycaprolactone， PCL)为主体，通过微图案化、三维打印技术、固定生长因子等手段构建不同组分、结构、孔径、表面形貌等的牙骨质相、牙周膜相、牙槽骨相，有望实现牙周组织有序再生。
    2.联合生物材料的各类牙源性间充质干细胞
    2.1 牙周膜干细胞(PDLSCs)
    PDLSCs通常来源于拔除的第三磨牙上附着的牙周膜。有研究显示来自年轻供体的PDLSCs较年龄更大供体具有更好的增殖、分化和免疫抑制能力。体外实验结果表明使用不同信号分子(细胞因子、阿司匹林等)作用于PDLSCs能够增强其成骨、成牙骨质及矿化能力。PDLSCs联合单相材料已被证明在临床试验中取得一定牙周再生效果。
    将三层自体PDLSCs细胞膜片与β-TCP支架结合，能实现牙槽骨高度增加、探诊深度(probing depth， PD)及临床附着丧失(clinical attachment loss， CAL)减少。而另有2项临床对照试验指出PDLSCs联合异种骨替代材料组与单纯使用骨替代材料组相比，PD、CAL及牙龈退缩水平无显著差异，但干细胞组显示出更积极的长期再生趋势。
    除了联合骨组织相支架，近年来越来越多研究关注PDLSCs联合牙周膜相材料的设计。Yang等在多层定向排列的PCL静电纺丝膜中加入明胶和京尼平交联形成三维支架，搭载PDLSCs植入大鼠牙周缺损处，对齐排列PCL支架组能够新形成有序排列的牙周韧带组织，其平均角度较随机排列PCL支架组更接近天然牙周韧带，说明模仿牙周韧带的对齐排列结构有助于功能性牙周韧带定向再生。
    Pilipchuk等以PCL和聚乳酸-羟基乙酸(polylactic-co-glycolic acid， PLGA)为主体构建双相支架，其中骨组织相采用无定形PCL固定骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7， BMP-7)并搭载成纤维细胞(gingival fibroblasts， GFs)，牙周膜相采用PCL/PLGA并对表面进行微图案化处理，使得微图案上的凹槽与原生牙周韧带的斜行方向对齐，固定血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor-BB， PDGF-BB)并搭载牙周膜细胞(periodontal ligament cells， PDLCs)，将该支架植入大鼠牙周缺损处能有效再生骨及牙周膜组织，但较少观察到牙骨质再生。
    另一项关于双相PCL支架的研究设计了骨组织相的多孔支架和牙周膜相的纤维膜，比较分别搭载牙龈细胞、骨髓间充质干细胞、PDLCs各自的细胞膜片在羊牙周缺损模型中的再生效果，结果显示，相对于无细胞支架对照组，添加终末分化的牙龈细胞对牙周膜再生的效果较差，而骨髓间充质干细胞和PDLCs组在新形成牙槽骨、牙骨质、牙周膜方面的效果相当。以上研究结果表明PDLSCs可作为牙周再生组织工程的种子细胞应用，且联合以PCL为主体设计的双相支架能够有效形成牙周纤维垂直插入新沉积的牙骨质层以及新生的牙槽骨结构。
    2.2 牙髓干细胞(DPSCs)
    DPSCs通常从恒牙(拔除的第三磨牙或前磨牙)牙髓中分离获得，而SHEDs从脱落的乳牙牙髓中获得，代表更不成熟的DPSCs亚群。有研究证明来自年轻供体的DPSCs较老年供体具有更好的抗凋亡能力，提示牙源性干细胞的活性受供体的影响，来自更年轻供体、更不成熟组织的干细胞将表现出更高的活性。另有体外实验结果显示牙周炎患者供体来源的DPSCs与GMSCs较健康对照组表现出更强的增殖及成骨能力，提示牙源性干细胞的供体来源范围并不局限于健康人群，可以拓展到牙周炎患者人群。
    SHEDs结合羟基磷灰石支架应用于大鼠牙周缺损模型可下调大鼠牙周组织基质金属酶-8、上调血管内皮生长因子的表达，可能有助于初始牙槽骨重塑。单纯SHEDs及结合经处理的牙本质基质(treated detin matrix， TDM)在大鼠牙周缺损模型、小鼠实验性牙周炎模型中均表现出再生牙周膜牙槽骨复合体的能力。
    目前关于SHEDs在牙周再生领域的研究相对较少，更多研究集中于DPSCs的获取与应用：体外实验表明，与PDLSCs和DFCs相比，DPSCs结合生物活性玻璃材料在成骨培养基上表现出更好的成骨分化潜能。DPSCs及其矿化的细胞外基质组成的矿化微球体较常规微球体可提高微球体中央细胞的活力，植入大鼠牙周缺损模型，矿化微球体组较常规微球体组可形成更高数量的骨组织、功能性牙周膜及牙骨质组织。
    Cao等建立小型猪牙周炎模型，通过注射法及细胞膜片法治疗牙槽骨缺损，结果显示DPSCs能有效促进牙槽骨再生，转染肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor， HGF)基因能显著增加新生牙槽骨体积，且细胞膜片法相对于注射法牙周再生的效果更显著。Monti等使用特定医疗器械分离过滤获得包含DPSCs及其细胞外基质的微移植物，实现DPSCs无需培养快速使用，将DPSCs与胶原海绵支架结合进行一系列临床研究，结果显示两者结合能显著降低PD及CAL，增加牙槽骨高度，但牙龈退缩未见明显改善。
    DPSCs联合双相或多相支架呈现出较好的牙周复合体的再生表现。Yan等使用静电纺丝技术构建以胶原蛋白/壳聚糖/聚环氧乙烷为主体的非对称性结构贴片，设置屏障层和功能层，并且在功能层中嵌入DPSCs，在大鼠和小型猪牙周缺损模型中均取得较好的完整牙周再生效果。
    Lee等使用三维打印技术构建PCL多相支架，分别为100 μm 微通道的牙骨质相、600 μm 微通道的牙周膜相以及300 μm微通道的牙槽骨相，分别递送重组人牙釉蛋白、结缔组织生长因子和骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2， BMP-2)，各相联合DPSCs植入免疫缺陷小鼠的皮下可以形成类骨、类牙骨质的矿化组织和连接两部分的类牙周膜结缔组织，但仍需通过原位再生模型行进一步研究。
    2.3 牙龈间充质干细胞(GMSCs)
    GMSCs是从牙龈组织中分离得到的干细胞，可通过牙冠延长术、牙齿拔除术或从上颌结节处获得牙龈组织。体外实验通过降低培养基更新频率来模拟较差的生长环境，结果表明在生长条件有限的情况下GMSCs较PDLSCs表现出更好的增殖能力。另在小鼠牙周炎模型上证实通过尾静脉注射行系统移植GMSCs表现出良好的牙周再生能力及调节脂质代谢和炎症反应的能力。
    GMSCs的浓缩条件培养基(conditioned medium， CM)在大鼠牙周缺损模型中能有效形成新的类牙骨质、斜行牙周膜以及新生骨组织，且较PDLSCs-CM表现出更优越的抑制炎症反应的能力。以上研究提示GMSCs较PDLSCs在炎症环境下更具应用潜力。
    联合β-TCP支架和胶原膜材料，Abdal-Mahab等使用自体牙龈组织分离得到的GFs/GMSCs开展一项随机对照试验(randomized controlled trial， RCT)研究，结果显示与无细胞组相比，GFs/GMSCs组展现出较好的牙槽骨高度及CAL、PD减少。且前3天GFs/GMSCs组龈沟液中的PDGF显著高于无细胞组。该研究提示牙龈来源的GFs/GMSCs具有牙周再生的潜力，而现有的无孔胶原膜因为阻断了自体牙龈相关细胞的迁移可能降低牙周再生的效果，提示胶原膜材料存在改良空间。
    2.4 牙囊干细胞(DFCs)
    DFCs是由牙胚(主要为未成熟的第三磨牙)中的牙囊组织分离获得的干细胞，是成牙骨质细胞、牙周膜细胞、成骨细胞的前体细胞。在犬实验性牙周炎模型中，与PDLSCs细胞膜片相比，DFCs细胞膜片在体内的新生牙槽骨质量更好，且能形成厚度较均匀的薄层牙骨质和斜向排列的牙周膜组织。结合体外实验结果：使用牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激能抑制PDLSCs分化，但能促进DFCs成骨基因表达，提示在牙周炎慢性炎症微环境中，DFCs相比PDLSCs显现出更好的牙周再生潜力。
    研究者将人DFCs细胞膜片复合TDM植入裸鼠皮下及犬牙周骨缺损处，可观察到形成新生骨、牙骨质样矿化组织以及连接二者的类Sharpey纤维。在牙周缺损原位模型中比较TDM与β-TCP支架复合DFCs细胞膜片的牙周再生效果，观察到TDM对于牙骨质样组织的形成更具优势，提示TDM作为单相骨组织支架的应用潜力。
    2.5 根尖乳头干细胞(SCAPs)
    SCAPs是从未成熟恒牙(主要为第三磨牙)根尖乳头中分离得到的间充质干细胞。由于根尖乳头在发育过程中会分化成牙髓，SCAPs只能在牙齿特定发育阶段被分离出来，因此SCAPs的获取存在一定局限性。将SCAPs悬液注射于小型猪牙周骨缺损处，12周后观察到实验组的牙槽骨再生、临床附着水平显著提升，PD减少，且组织病理结果显示实验组形成典型的Sharpey纤维结构、大量的牙周膜组织、更厚更成熟的牙骨质。
    Dutta等使用三维打印技术构建以聚乙二醇和聚丙二醇的合成嵌段共聚物P407为主体的水凝胶搭载SCAPs，具有良好的生物相容性，辅助应用电磁场后可增强SCAPs的增殖、迁移能力和成骨表达水平，显示SCAPs联合水凝胶应用的潜力。但由于其成骨/成牙本质分化潜能，更多研究关注SCAPs在牙髓/牙本质再生、生物根工程中的应用，其在牙周再生中的应用研究较少见。
    3.总结与展望
    联合生物材料的牙源性间充质干细胞已经在牙周组织再生方面显现出重要的应用潜力。现有研究表明，牙周膜干细胞是能够实现真正意义上牙周组织再生的最有潜力的种子细胞。将牙周膜干细胞联合生物材料植入动物牙周缺损模型不仅实现有效骨再生，而且获得了新生牙骨质和牙周韧带组织。临床研究也证实，生物材料搭载牙周膜干细胞可实现牙槽骨高度增加、牙周探诊深度和附着丧失减少。
    目前有限的证据支持牙髓干细胞、牙龈间充质干细胞、牙囊干细胞具有一定的牙周再生潜力，且研究选取的动物模型较为多样，降低了实验结果的可比性。从生物材料角度，与单相支架材料相比，双相及多相支架材料通过针对牙周组织不同结构、功能的特点进行设计，目前的研究均取得一定的牙周再生效果，具有更强的应用潜力。但同时由于牙周组织各部分的组成成分、机械性能、生长及重建速度等不同，多相支架材料的空间稳定性、降解性能和干细胞的增殖分化以及新生组织再生之间的平衡需要更精准地调控与优化，从而实现各部分时空特异性有序再生的目标。
    从牙源性干细胞选择的角度，DPSCs、SHEDs、PDLSCs更易从废弃的牙或牙周组织中获得，GMSCs可较广泛从牙龈组织中获得，而DFCs和SCAPs收集和提取的要求更高。目前牙源性干细胞的临床应用集中于自体移植，移植结果证明其临床应用的安全性及可行性，但自体移植受到细胞来源限制，要求患者自备多余的牙齿或组织提供细胞来源。多种干细胞经冷冻保存不影响增殖及分化能力可能为其临床应用提供基础，依托这一技术可以建立牙源性干细胞库，扩大牙源性干细胞的应用范围，使异体移植成为可能。干细胞本身拥有低免疫原性的优势，但应用于人体的结果仍缺乏高质量临床研究证据，其应用的安全性及潜在风险有待进一步研究。