齿龈内阿米巴与牙周炎相关性的研究进展

    牙周炎是造成世界范围成人失牙的主要原因，菌斑生物膜是疾病发生的先决条件。人类口腔中除了细菌外，还包含病毒、真菌、古细菌以及原生动物等其他微生物。齿龈内阿米巴（E.gingivalis Gros，1849）是第一个被报道的人体阿米巴原虫。其同属的溶组织内阿米巴（E.histolytica）是一种致病性原虫，可引发阿米巴病。而E.gingivalis在牙周炎患者牙周袋内具有高检出率且与E.histolytica 存在密切的生物学联系，因此被认为可能与牙周炎相关。
    1. E.gingivalis与牙周炎相关性的研究历程
    1.1 E.gingivalis 与牙周炎的早期研究
    E.gingivalis 在人群中呈世界性分布，其检出情况不仅与口腔卫生状况、牙石量有关，还与某些口腔疾病存在一定联系。早在上个世纪就有研究发现，E.gingivalis在牙周炎中呈现出较高的检出率。Wantland等在1 9 6 0年报道了7 0 0例受试者口腔中的E.gingivalis 检出情况，其中健康者的检出率仅为26.4%，而早期牙周炎患者为65.2%，晚期牙周炎患者则达到100%。
    Linke等的研究结果显示，E.gingivalis 在龈沟深度为1~3mm 处的检出率为29%，而在牙周袋超过4mm处的检出率高达71%。Gottlibe等进一步在镜下观察了E.gingivalis检出阳性的牙周炎患者牙龈组织切片，发现其在重度牙周炎中比中度牙周炎更常见。因此，部分学者将E.gingivalis视为一种可疑的牙周致病体。
    然而E.gingivalis 在健康人群中也并不少见。Dao等发现口腔健康者中E.gingivalis的检出率达32%。国内报道的健康人群平均感染率为38.88%。所以有观点认为，E.gingivalis是一种无害性的共生微生物，它与疾病的联系主要在于口腔卫生不良导致了食物残渣和细菌的增加，从而为其提供了食物来源。但它具有转变为机会性致病体的可能。当宿主的免疫功能异常时，E.gingivalis可能在牙周炎中发挥作用。
    随后有动物实验证实，在免疫抑制大鼠口腔中感染E.gingivalis 可导致牙周病。但需要注意的是，这两项研究中均未设置免疫正常的大鼠作为对照，因此其实验设计尚有待进一步完善。
    1.2 不同研究间的异质性
    以往的不同研究对于E.gingivalis的检出结果存在很大差异而难以得到一致性结论。一方面是由于牙周病学的发展，牙周炎的诊断和分类标准不断完善和细化，所以不同年代的研究对于牙周状况的判定依据有所不同。另一方面，不同研究的取样部位和方法（如沿龈缘处刮取菌斑、牙周袋最深处刮取菌斑、采集唾液及龈沟液等）缺乏统一的标准。此外，有学者还指出检测位点的数量会影响检出结果的准确性，对于牙周炎患者口内E.gingivalis的检测应至少包含5~10个随机位点。
    更重要的是，以往的大多数研究是通过显微镜下观察来识别E.gingivalis。然而，E.gingivalis 在形态上容易与巨噬细胞混淆。因此有学者探索了其他检测方法。Kikuta等率先使用PCR技术，根据E.gingivalis 的小亚基核糖体RNA（SrRNA）设计引物用于鉴别和检测E.gingivalis。随后对引物设计优化的研究结果显示采用PCR技术检测E.gingivalis 的敏感度和特异度明显优于镜下检测。
    Trim等进一步应用实时定量PCR检测E.gingivalis 相较于传统PCR更加敏感且可定量分析，该研究中牙周炎患者炎症位点的E.gingivalis 检出率为69%，而在健康者及牙周炎患者的健康位点中均未检出。综上可知，既往的很多研究中对于E.gingivalis的检出结果有待商榷。
    1.3 E.gingivalis 与牙周炎的最新研究
    García等在2018年基于18SrRNA鉴别出新的E.gingivalis 亚型将其命名为E.gingivalis ST2（kamaktli variant），将此前的命名为E.gingivalis ST1。随后，Zaffino 等使用TaqManPCR技术重新设计引物和探针并与传统PCR进行对比，结果显示采用TaqMan PCR可检出ST1、ST2两种亚型，而传统PCR技术只能检出ST1型。说明过去采用传统PCR检测E.gingivalis的结果也并不完全准确。在包含两种亚型的情况下，该研究在牙周炎患者龈下菌斑中的E.gingivalis检出率为74%。另一项近期的研究在牙周炎患者龈沟液内的总检出率更高达88.3%，而健康者仅为13.3%。
    最新的体外实验还表明E.gingivalis 在牙周组织中具有较强的毒力作用。但同时应注意到，不同亚型在感染中表现出了不同的行为模式。近期研究显示，ST1型的检出与牙龈指数（GI）、临床附着丧失（CAL）相关；ST2型与探诊深度（PPD）相关。由此可见，两种亚型很可能具有不同的致病性和毒力作用。此外，最近有学者报道E.gingivalis在101例种植体周围炎患者病损部位的检出率达到30.7%，而在40例种植体周围健康者中未能检出。但该研究是采用镜下检测法，E.gingivalis 在种植体周围组织中的流行情况需要进一步探究。
    另一方面，随着组学分析的兴起，Deng等对人牙周袋内包含宿主在内的所有生物体的转录活性进行了分析，发现E.gingivalis 的核糖体RNA（rRNA）丰度仅次于人体rRNA位居第二位，这部分RNA占慢性牙周炎患者总RNA读序列（reads）的6.5%，而在牙周健康者中仅占0.4%。这提示E.gingivalis在疾病发展过程中大量增加。
    综上所述，近年来越来越多的研究显示，E.gingivalis 与牙周炎之间可能存在更为密切的联系，而不应仅将其视为一种机会性致病微生物。
    2. E.gingivalis可能的相关致病机制
    E.gingivalis 在牙周袋内会以宿主细胞、细菌等为食。同属的E.histolytica 在摄入细胞时存在吞噬（phagocytosis）和胞啃（trogocytosis）两种方式，而E.gingivalis的相关机制尚未被描述。有趣的是，一些被阿米巴吞噬的细菌有可能存活下来，甚至可以在原虫内进一步繁殖。此时的阿米巴则能够帮助细菌躲避人体免疫反应或某些抗菌治疗。因此，一些牙周致病菌可能通过此种方式得到E.gingivalis的保护，并随着E.gingivalis 的运动被播散至其他部位。
    白细胞介素-8（IL-8）是中性粒细胞的趋化和激活因子，在急性炎症中发挥重要作用。E.gingivalis 感染后的牙龈上皮细胞和牙龈成纤维细胞IL-8表达明显上调，E.gingivalis感染的牙周炎患者血清中IL-8水平也显著升高。这也就解释了E.gingivalis的周围通常被大量的中性粒细胞所包绕这一现象。然而Bonner等指出，在镜下可以观察到E.gingivalis 周围的中性粒细胞内容物发生了改变，提示E.gingivalis可能通过触发某些信号使细胞发生了修饰。
尽管其机制尚未明确，但这样的变化意味着作为抵御牙周致病菌第一道防线的中性粒细胞的功能受到了影响。另一方面，体外试验已证实中性粒细胞在牙周致病微生物的诱导下会产生大量活性氧。而活性氧和抗氧化系统之间的稳态失衡所引起的氧化应激与牙周破坏相关。据报道，E.gingivalis阳性的牙周炎患者唾液中过氧化脂质产物丙二醛显著升高，其含量能直接反映脂质过氧化的速率和强度并与自由基浓度呈正相关。因此，E.gingivalis感染后还可能会引发氧化应激而参与牙周破坏。
    蛋白水解酶，如半胱氨酸蛋白酶是E.histolytica 的重要毒力因子。E.histolytica 包含50个半胱氨酸蛋白酶基因。有学者猜测E.gingivalis 可能也具有相似的基因，通过产生蛋白水解酶参与牙周破坏。刘光英等指出，电镜细胞化学反应研究证实E.gingivalis有溶酶体且含有多种水解酶。其中，酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的标志酶，E.gingivalis 阳性的牙周炎患者唾液中ACP含量显著升高。因此推测，虫体死亡时释放的水解酶可能引起牙周组织溶解破坏。此外，基质金属蛋白酶（MMPs）是与牙周组织破坏相关的蛋白溶解酶家族，其中MMP-13在慢性牙周炎患者唾液中显著升高。
    Bao 等在体外实验发现，E.gingivalis和牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）都会抑制牙龈上皮细胞增殖，同时，E.gingivalis 感染后牙龈成纤维细胞的MMP-13基因表达上调了11.2倍，而P.gingivalis 感染后仅上调3.7倍。此外，他们的研究还发现，在健康的牙龈活体组织中未发现E.gingivalis 入侵。这与早期研究中所观察到的情况一致。而人为对牙龈上皮制造轻微破坏后，便可观察到E.gingivalis侵入组织。因此，E.gingivalis可能得益于牙周炎所导致的袋内上皮的破坏，继而进一步入侵牙龈组织。
    需要指出的是，E.gingivalis难以培养的问题一直是研究其生物学特性的瓶颈。因此，目前对于E.gingivalis 的基础研究还很匮乏，相关致病机制的研究还需进一步探讨。
    3. E.gingivali感染的治疗
    机械治疗是牙周治疗中最常用且最有效的方法。Rashidi Maybodi等进行的随机临床试验结果显示，中重度慢性牙周炎患者在接受刮治和根面平整术（scaling and root planning，SRP）后，唾液及牙面菌斑中的E.gingivalis 水平明显下降。但另一项近期研究却发现，SRP对于牙周炎患者龈沟内的E.gingivalis ST1和ST2型均无明显影响。两项研究截然不同的结果需要谨慎看待。
    前者采用镜下观测法检测E.gingivalis，且未将原虫的减少与牙周临床指标相联系，后者使用TaqMan PCR技术检测了两种亚型。另外，两项研究的取样部位以及牙周炎诊断和分类的依据也不同。因此，牙周机械治疗是否能有效清除E.gingivalis，以及E.gingivalis的清除是否与牙周状况改善相关，还需要更多设计完善的临床研究予以证实。
    药物治疗是牙周机械治疗的辅助手段。甲硝唑是治疗阿米巴和毛滴虫感染的常用药物。使用甲硝唑治疗原虫口腔感染时，成人常规推荐剂量为每天3次，每次400mg，为期1周。当患者存在免疫缺陷或合并有其他部位感染等情况时，药量和用药时间应适当增加。近期，Moroz等通过体外实验对比了14种常用漱口液对E.gingivalis 的杀灭效果，结果显示这些漱口液均能发挥杀伤虫体的作用，其中洗必泰在清除原虫方面的高效作用得到了确认。
    4.结语 
    随着检测和分析技术的不断发展，E.gingivalis 的研究进一步深入。但是目前对于E.gingivalis 亚型分类的依据是已测序的基因序列，未来仍需不断完善和细化。不同亚型间是否具有不同的致病性和毒力作用还尚待探究。E.gingivalis与其他口腔微生物的相互作用也需要进一步阐明。
    总之，E.gingivalis与牙周炎相关性的研究在未来还具有广阔的空间，对于二者相关性的研究将为我们认识牙周炎的发生发展提供新的视角。