口腔是人体与外界环境进行物质交换的主要场所，口腔健康关系到机体各个系统的稳定与健康，同时口腔也是一个十分复杂的微生态环境，在口腔内已检测出700 多种不同的细菌定植。口腔颌面部疾病的发生发展常与某种病原微生物数量增加有关。测序技术是一个逐年迅速进步的技术领域，它推动了医学科学研究的发展，并正在以巨大的影响渗透到临床应用中。
高通量测序技术可以快速、经济且高效地获取序列数据，从而识别序列中常见和不常见的变异，应用于癌症病因学检查及基于NGS 的分子诊断中。作为精准医疗的基石，高通量测序在探索口腔颌面部疾病的病因及后期诊疗预后过程中，阐明疾病的表观遗传学和基因组学分子基础。为精准的对口腔颌面部疾病的分类、诊断、治疗提供了基因分子层面的保障。本文归纳总结了基因测序平台的发展历程和下一代测序技术在口腔颌面部疾病中的实践与应用。
1.高通量测序技术发展
在过去几十年中，基因测序取得了重大进展，成为基因遗传、突变分析的首要方法。从DNA、RNA 测序到单分子、单细胞和空间转录组方法的革命，使得越来越精确的单个细胞信息与空间信息相结合。与此同时，对基因检测及测序技术的需求也日益增多，这也鞭策着新一代测序技术的出现。
1.1 第一代测序技术
第一代测序技术也被称为Sanger 测序。自DNA 双螺旋结构被发现后，Sanger 在1975 年提出了世界上首个基因测序方法“双脱氧测序法”。Sanger 测序的读取长度为800 bp，相较于高通量测序（Illumina），其阅读容量较低，且花费的时间及费用较高。但是在一代测序出现后的30 年中，Sanger 测序凭借其操作简便且稳定性、准确性良好而主导着市场。
1990 年，在一代技术的逐渐成熟及帮助下，人类基因组计划（human genome project，HGP）正式启动，其目的是检测人类基因组的整个DNA 序列，并破译所有人类基因信息。这次计划的启动，是基因测序事业的伟大里程碑，疾病病因的探索正式进入基因组学时代。
1.2 高通量测序技术
高通量测序技术又称“二代测序”或“下一代测序”，该技术通过在反应中加入延伸引物，使其与待测序列的末端结合，生物酶或生物化学方法随后清除多余的反应底物，使反应只在目标序列上进行。最后，检测新生成片段的生物信号，从而在同一时间对成千上万对碱基对进行基因测序。常见的二代测序检测方法包括全基因组测序、全外显子组测序、靶向测序及RNA测序等。
全基因测序（whole genome sequencing，WGS）是指对整个基因组进行测序，可用于识别广泛的实质性/种系，包括正常和罕见变异、核苷酸替换、插入和删除、拷贝数变异（copy number variations，CNV）、染色体修饰和非编码区检查。全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）以基因组的编码区（外显子）为目标，发现与疾病或表型相关的罕见或常见变异，检测范围只占人类全基因组的2.5%。
据最新研究，目前已知的疾病相关基因中约有85%是在外显子组中发现的，出于此原因，近年来WES 已被广泛用于临床研究。相比较于WGS，WES 通过利用对指定疾病的定向测序进行检测，可以实验室节省时间和操作成本，从而为临床提供更准确、更便捷的测序服务。在二代测序技术出现后，多种平台迅速出现。其中Illumina平台和Roche 454 平台最为常见。
2005 年出现的Roche 454 平台是第1 个二代测序平台，其通过焦磷酸测序的测序方式，将引物上的dNTP 聚合和荧光信号释放偶联起来，检测荧光信号的强弱，从而实现实时检测DNA 序列。虽然Roche 454 平台测序速度快，精准度较高，但是由于其高昂的测序成本等原因，目前已经停止测序服务。2006 年Solexa 公司发明了Solexa 测序技术，后被美国的Illumina 公司收购后，Illumina 平台才真正出现。Illumina 测序原理与Sanger 测序原理相似，使用合成测序和光学信号检测，通过4 种不同的荧光标记核苷酸和光学成像来可视化生长的互补链。
相较于Sanger 测序， Illumina 平台的读取长度虽然只有300 bp，但是其测序通量比Sanger 测序提高了100 倍。Illumina 平台通过其高精准度、高灵敏度、高特异性以及相对较低成本的优势占据了主要的测序市场。继前两种平台的进步发展，陆续出现了SOLiD、Ion Torrent、Ion S5 等新二代测序平台，这些技术也同样促进着生命科学和精准医学的快速发展。
1.3 第三代测序技术
伴随二代测序技术的日渐成熟，为了改善前两代读取长度短、长序列的错误组装及间隙等问题，第三代测序出现。第三代测序技术（third-generation sequencing，TGS）相较于前两代测序技术，具有超长读取长度、运行快、无需模板扩增、直接检测表观修饰位点等特点。
第一个真正意义上的三代测序是单分子实时测序（single-molecule real-time sequencing，SMRT），不在进行PCR 扩增的同时，还能通过边合成边测序的逻辑，实现了对单分子DNA 进行单独测序。第三代测序技术为研究人员提供了更长的读取长度，其读取长度可以达到300 kb。在实现对序列进行更统一、更直接的评估的同时，并规避了短读技术的限制。但是由于其测序精准度还不及前两代，使其在临床上还未广泛地普及。
1.4 RNA 测序技术
RNA 测序（RNA-Seq）是对细胞的全部RNA 进行分组，从而获得有关突变/单核苷酸多态性、基因表达水平、基因融合、基因组调整、等位基因特异性表达、转录后改变、microRNA（miR-NA）及long non-coding RNA（lncRNA）的数据。作为高通量测序的重要组成部分，RNA 测序（RNA-seq），特别是单细胞RNA 测序（single-cell RNA sequencing， scRNA-seq）常用于肿瘤相关分子诊断学中，该技术提供了单个肿瘤细胞的生物学信息，分析肿瘤内表达异质性的决定因素，并确定许多肿瘤疾病形成的分子基础。但是该技术存在一定的错误率、测序成本较高、难以获得高质量的转录图谱等缺陷，目前还有很大的进步空间。
2.高通量测序技术在颌面疾病中的应用
2.1 口腔颌面部恶性肿瘤
2.1.1 涎腺腺样囊性癌
涎腺腺样囊性癌（salivary adenoidcystic carcinoma，SACC）是一种罕见的恶性肿瘤，起源于大、小唾液腺。SACC 是一种上皮源性恶性肿瘤，生长缓慢但呈浸润性生长，肺转移和神经周围扩散发生率高。尽管积极进行手术切除，但肿瘤复发率高。与其他类型的癌症不同，SACC 对放射治疗不敏感，没有预测性的生物标记物，也没有新的靶向治疗被批准用于SACC。
肿瘤组织的肺部转移及局部复发是导致SACC 死亡率高的主要原因。microRNAs 与许多种人类癌症中的抑癌基因或原癌基因有关，目前已有报道许多microRNAs 及其靶向mRNA 在SACC 的生长和转移中发挥重要作用。
Han等研究利用高通量测序比较6 对SACC 肿瘤及其相应的癌旁正常腺体中microRNA 和mRNA 的表达谱，发现3 对标记的核心microRNA-mRNA （hsa-miR-675-5p＆CA6；hsa-miR-885-5p＆SCUBE3；hsa-miR-885-3p＆BOD1L2）可能通过调控靶基因表达来影响DNA 复制、基因表达、细胞周期、细胞分裂、代谢过程和信号转导。而上皮间充质转化是SACC 肺转移的关键过程，其中SCUBE3 通过上皮间充质转化而影响SACC 远处转移。SACC 相关的潜在分子机制的阐明为抗肿瘤新的治疗靶点提供了线索。
2.1.2 口腔鳞状细胞癌
口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是全球常见的口腔恶性肿瘤。其具有不同分化的程度，分化差的OSCC 有早期向淋巴结转移趋势。最新统计显示，口腔鳞状细胞癌患者5 年生存率约为60%，而晚期患者5 年生存率则更低。OSCC 生存率缺乏改善的主要原因是由于肿瘤组织的局部复发及远处转移。超过80%的侵袭性头颈部鳞状细胞癌过表达表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR），EGFR 常与肿瘤侵袭和转移、放疗和化疗耐药性增加有关，导致患者存活率降低，肿瘤预后不佳。
间充质-上皮转化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）是一种酪氨酸激酶受体，作为肿瘤侵袭中介物而受到越来越多的关注。MET 高表达在口腔癌中也有报道。Yokokawa 等通过高通量测序对63 例OSCC 患者癌组织中EGFR、MET 进行检测，发现EGFR 和MET 蛋白的高表达与OSCC 预后不良有密切关系，提示临床上通过检测EGFR 和MET 蛋白表达可能有助于评估OSCC 患者的预后。
环状RNA（circRNA）是一类没有5’端帽或3’端poly（A）尾的非编码RNA 分子。研究证明circRNA 在调节肿瘤发展中起着至关重要的作用。Su 等对37 例OSCC 患者环状RNA检测发现，环状RNAhsa_circ_0005379 在OSCC 组织中的表达明显低于配对的非肿瘤性匹配组织，且与肿瘤大小和分化有关。
对实验标本进行高通量测序，获得环状RNA 谱后，发现hsa_circ_0005379 是一种与肿瘤大小和分化相关的口腔鳞状细胞癌的抑癌基因。hsa_circ_0005379 上调后，可在体外有效抑制癌细胞的迁移、侵袭、增殖和血管生成，并抑制体内肿瘤组织的生长。并且hsa_circ_0005379 可能通过干预EGFR 的表达而影响EGFR通路的正常运作。hsa_circ_0005379 的高表达联合西妥昔单抗治疗可明显促进癌细胞的凋亡。因此，hsa_circ_0005379 对OSCC 的作用可能成为OSCC 靶向治疗的新治疗靶点。在口腔鳞状细胞癌的检测方面，在高通量测序技术快速发展的推动下，液体活检技术也逐渐开始用于肿瘤的筛查。
Cui等使用高通量测序对OSCC 患者唾液及血浆液体样品的游离DNA（cell-free DNA， cfDNA）进行靶向深度测序来检测循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）。实验发现患者液体活检中ctDNA 的存在说明肿瘤复发的可能性会大大增加。患者在进行肿瘤治疗前，结合血浆和唾液进行口腔癌液体活检的检出率为100%。液体样本中ctDNA 的出现比临床病理确诊早约4 个月，这将为OSCC 分子水平的早期诊断提供新思路。
2.2 先天性畸形
2.2.1 非综合征型唇腭裂
非综合征型唇腭裂（non-syndromicoral clefts，NSOCs）是一种排除了其他系统畸形和综合征，单独出现唇裂、腭裂或唇裂合并腭裂的唇腭裂疾病。在我国每1000 名新生儿就有1.39～1.46 名儿童患有非综合征型唇腭裂；NSOC 因缺损的解剖位置不相同常分为3 个亚型，单纯腭裂、单纯唇裂和唇裂合并腭裂，由于发病遗传机制及发病外界因素相似，后两种类型统一定义为非综合征型唇裂合并或不合并腭裂（cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）。
周仁等通过Illumina 平台对具有阳性NSCL/P 家族史的24 个家系进行WES 测序，再通过159 个NSCL/P 患者对WES 获得的阳性信号进行单位点分析、亲源效应验证。发现SPRY 基因中rs1298215244 位点T ＞ C 变异、rs504122 位点G ＞ C 变异和rs504122 位点G＞T 变异与NSCL/P 存在关联。由于SPRY 蛋白能够参与和调节受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK)和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGF）信号通路的正常表达，而影响人体生长发育。
因此实验中发现的变异位点可能通过干预SPRY 蛋白的正常生成而影响相关通路的表达，进而影响胚胎生长及胚胎颌面部的正常发育。通过研究SPRY 变异位点与NSCL/P 发病的关联，可以对将来进一步开展NSCL/P 患病预测、遗传及产前筛检、积极采取预防措施提供理论依据。
2.2.2 特雷彻柯林斯综合征
特雷彻柯林斯综合征（Treacher Collins syndrome，TCS）是一种罕见的常染色体显性遗传疾病，主要表现为颧骨复合体发育不全，下颌小颌及后缩，鼻子突出，形成独特的“鸟样”脸，伴随眼睑缺损、睑裂下倾、睫毛稀疏、唇裂，及导致传导性听力损失的外耳或中耳畸形等发育异常。
TCS 主要由于RNA 转录、核糖体生物合成、神经嵴细胞迁移受阻从而导致第一和第二鳃弓发育不良。目前，已发现与核糖体生物合成和合成相关的3 个基因（TCOF1、POLR1D 和POLR1C）是导致TCS 患者异常的原因。Li 等采用Illumina测序与多重连接探针扩增技术 （multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）检测到了TCOF1 中包含外显子9-13（exons 9-13）的新型粗略缺失，是首例由TCOF1 中多个外显子缺失和POLR1D 突变引起的中国TCS 病例。
通过应用高通量测序扩大了中国人群中TCS 的突变谱，证明了TCS 的遗传异质性的同时，突显了高通量测序技术在分子诊断学及遗传学方面的优势。
3.高通量测序技术在口腔微生物探索中的应用
微生物作为一个复杂有序的微生物网络，在人体的各个部位发挥着重要作用，存在于皮肤、口腔、胃肠道、呼吸道和生殖系统的黏膜表面。口腔是一个高度动态的微生物环境，包含许多不同的微环境，容纳着由细菌、真菌和病毒组成的700 多种不同微生物群落。
随着宏基因组学测序技术的诞生和对细菌群落的深入认识，发现人类微生物群的生态失调与多种疾病的发病机制和发展有关。da Costa 等通过16S rRNA 基因进行Illumina测序确定了24 个来自牙齿不同表面的生物膜微生物组成，获得了3223479 个高质量序列。再将16S rRNA 基因序列聚类成OUT，最终检测出10 个细菌门、27 个类、38 个目、57 个科、118 个属和340 个物种。据研究发现，生物膜成熟和龋齿病变进展的特点是革兰氏阴性厌氧菌数量的增加，其中韦永氏菌和普雷沃氏菌居于此列。此外，龋病的进展与链球菌数量的分布密切相关。
有趣的是，当龋病的发展处于停滞期时，链球菌、双歧杆菌、异位杆菌、普雷沃氏菌、韦荣氏菌和糖杆菌丰度也很高。这一发现为生物膜在龋齿进展和停滞中的作用提出了创新性的见解，并为未来对龋病筛查及评估提供了全新的生物标志物。高通量测序不仅有助于深入了解微生物环境的组成和结构，同时也可协助探究口腔微生物与全身疾病之间的关联。
Plachokova 等采用宏基因组测序技术对重度和轻度牙周炎患者的牙周袋样本中的唾液和龈下微生物进行分析，以确定牙周炎与全身炎症之间的关联。实验结果表明，在牙周袋中检测到的牙髓卟啉单胞菌、短弯杆菌和隐球菌等微生物与全身炎症标志物呈现正相关性；同时，在粥样斑块中检测到的丙酸杆菌属和细小杆菌属在严重牙周炎组的唾液和龈沟中数量明显增加。这些研究成果为进一步研究牙周病与心血管疾病之间密切联系提供了微生物学基础。
