种植体骨结合过程中免疫细胞作用的研究进展

    骨结合，即有生命力的骨组织与负荷的种植体表面的直接接触或连接。在种植修复的过程中，种植体是否能与牙槽骨形成稳定良好的骨结合是决定种植体长期临床效果的关键因素。而作为植入宿主机体内的异物，种植体与机体之间的免疫互动直接影响其最终的骨结合效果。
    骨结合过程中的免疫反应主要表现为局部的炎症，前期研究认为炎症反应会导致种植体周围健康组织的破坏和纤维包裹的形成，最终造成骨结合的失败，因而希望种植体能通过避免炎症反应的发生来促进骨结合。但越来越多的研究表明过度抑制炎症反应同样会抑制新骨的形成从而影响骨结合进程，而对种植体周围免疫反应进行有效调节才是形成良好骨结合的关键。
    1.骨结合生理过程
    种植体植入后迅速被血液包裹，而后蛋白质、脂质、糖类等血浆成分吸附于其表面，影响后续免疫细胞，组织衍生细胞等的黏附。在补体蛋白的作用下，血浆中的血小板和凝血级联反应的其他成分黏附在种植体表面并被激活，共同作用形成种植体周围的血凝块。1~2天后，血凝块中包含的大量趋化因子、促炎细胞因子、生长因子等，招募并促进以中性粒细胞和巨噬细胞为主的免疫细胞黏附。而后，在肥大细胞脱颗粒等因素介导下，分别以中性粒细胞和淋巴细胞为主要反应细胞的急慢性炎症反应先后发生，肉芽组织形成，替代了种植体周围原有的血凝块。
    种植体植入后约1周，在成骨细胞的作用下，种植体表面开始形成编织骨。2周后，编织骨在种植体和种植窝原有骨之间形成桥接。与此同时，由免疫细胞诱导形成的破骨细胞在种植体与种植窝之间压力较大-即在种植体植入后提供初始稳定性处发挥作用，形成一定程度的骨吸收，而后伴随新骨形成，使机械稳定性向生物稳定性转变。最后，随着骨组织进一步矿化，编织骨依次转化为纤维骨和板层骨，在植入后约3个月，骨结合初步形成。
    2.参与骨结合的主要免疫细胞
    2.1中性粒细胞
    中性粒细胞是在种植体植入后最早被募集到种植体周围的免疫细胞之一，首先，其对于病原体和手术过程中产生的金属及骨碎屑的吞噬降解作用，有效保证后续的骨结合过程不受其他异物影响。但另一方面，中性粒细胞释放的蛋白水解酶和活性氧（reactive oxygen species,ROS）等活性物质，在对种植体和病原微生物造成损伤的同时，也会对种植体周围正常组织造成一定程度的破坏。
    此外，中性粒细胞还释放由颗粒蛋白质、中性粒细胞弹性蛋白酶、染色质DNA和组蛋白组成的中性粒细胞胞外陷阱。其主要作用是诱捕病原体并防止感染扩散，但它也会导致纤维基质过度产生，从而影响骨结合。
    中性粒细胞主要释放以白细胞介素-8（interleukin,IL-8）、CCL-2和CCL-4为代表的趋化因子，以及以IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等为代表的促炎细胞因子。前者可以募集更多的中性粒细胞以及单核-巨噬细胞到达种植体周围，后者则可进一步加剧局部炎症反应。
    中性粒细胞还可与T细胞共同通过表达核因子κB受体激活剂（receptor activator for nuclear factor-κBligand,RANKL）诱导破骨细胞生成，由于破骨细胞参与骨改建，在一定范围内，种植体周围的骨结合强度与破骨细胞活性成正比。但急性炎症期过度持续时，多种促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）及ROS会导致RANKL过表达，使破骨细胞活性过高，从而导致骨吸收甚至骨结合失败。
    由此可见中性粒细胞对骨结合的形成有双面作用，决定其能否对骨结合产生正面效果的关键，在于合理调控局部中性粒细胞的数量和作用时间，使其在清除病原体及金属碎屑与不破坏局部健康组织及激活破骨细胞间达到平衡。
    2.2巨噬细胞
    巨噬细胞可根据极化方式分为M1和M2表型，M1型巨噬细胞通常在急性炎症中起到吞噬外来微生物，促进炎症反应，招募其他免疫细胞，维持组织稳态等作用。而在急性炎症消退、组织恢复稳态后，M2型巨噬细胞又可以分泌抗炎细胞因子和生长因子，促进损伤修复。有研究证明，巨噬细胞耗竭小鼠骨缺损修复能力远低于正常小鼠，这充分证明了巨噬细胞在成骨过程中的重要作用。
    （1）M1型巨噬细胞：又称经典激活途径巨噬细胞，是由巨噬细胞与内源性的干扰素-γ、TNF-α和外源性的脂多糖等不同极化因子结合极化而来，主要分泌促炎细胞因子（包括IL-1、IL-6、TNF-α等）和活性物质中间体（包括ROS和一氧化氮合成酶）。以上物质与中性粒细胞等免疫细胞共同作用，在急性炎症期维持炎症反应的程度。
    由于M1型巨噬细胞的促炎作用，通常认为其会加剧种植体植入后因炎症造成的组织损伤，且长时间的炎症持续会在种植体周围形成纤维组织，不利于骨结合的形成。有研究发现，Ⅱ型糖尿病小鼠拔牙后，拔牙创内M1与M2型巨噬细胞比值相较正常小鼠显著增大，且拔牙创内新骨生成过程明显减慢，表明局部M1型巨噬细胞过多对成骨具有负面作用。
    但也有早期研究表明M1型巨噬细胞可通过COX-2和PGE2途径产生肿瘤抑制素M，进而抑制MSC中C/EBPα和过氧化物酶增殖活化受体γ的表达来减少间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的脂肪分化，同时促进C/EBPδ的表达。C/EBPδ受STAT3转录调控，并与Cbfal协同调控骨钙素和胰岛生长因子1等重要促成骨细胞分化和增殖因子的表达，促进MSC的成骨分化。与中性粒细胞相似，在成骨过程中，M1型巨噬细胞也表现出一定的两重性，因而寻找其在促炎与促成骨之间的平衡方面显得至关重要。
    （2）M2型巨噬细胞：又称交替激活途径巨噬细胞，根据激活其极化因子的不同，又分为M2a、M2b、M2c、M2d四个亚型。虽然M2巨噬细胞各个亚型的极化方式与分泌的细胞因子等不尽相同，但其总体作用大抵一致，即通过分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF），IL-4、IL-10等细胞因子促进组织修复和抑制炎症反应，因而M2型巨噬细胞在种植体周围骨结合过程中发挥着至关重要的作用。
    M2型巨噬细胞分泌的IL-4可增强MSC对BMP-2及Runx2的表达，并显著增加新生骨中矿化结节的含量；IL-10也可增强MSC对BMP-2及ALP的表达，而阻断IL-10的分泌则会抑制后续骨基质的矿化。与此同时，MSC也可通过外泌体和旁分泌两种方式促进M2型巨噬细胞极化。MSC可分泌含有miR-233的外泌体，通过下调Pknox1基因的表达抑制巨噬细胞的M1型极化。
    而旁分泌即通过分泌TGF-β3和TSP1促进Arg-1和IL-10的表达，进而促进M2型巨噬细胞的极化。关于巨噬细胞促成骨的多项研究结果证明，通过不同途径将M1型巨噬细胞转化为M2细胞在大部分情况下可以达到更好的成骨效果。
    （3）T细胞：根据T细胞的功能特征，可将其分为辅助T细胞（helper T cell,TH）、细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells,CTL）和调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）。Th细胞中的Th1与Th2细胞和巨噬细胞的M1与M2亚型类似,前者主要发挥促炎作用，分泌IFN-γ、TNF、IL-2等细胞因子，后者主要发挥抗炎作用，分泌IL-4、IL-10、IL-13等细胞因子，它们主要参与维持慢性炎症期组织中的细胞因子水平。
    一般认为Th17可通过表达RANKL直接激活破骨细胞，且其分泌的IL-17除直接作用并活化破骨细胞外，还具有促炎作用，可诱导其他免疫细胞产生TNF-α和IL-1，从而产生有利于破骨细胞的炎性微环境。CTL主要对病毒感染细胞和肿瘤细胞发挥杀伤作用，但也有研究证明人体CTL在骨折血肿处富集，可增加局部干扰素-γ和TNF-α，抑制MSC成骨分化，影响骨折愈合。
    而关于Treg,有研究表明其可产生外泌体促使巨噬细胞向M2型极化，并抑制M1型巨噬细胞对TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子的表达。并且Tregs还会分泌生长因子以促进内源性干细胞的再生，同时，由它诱导上调的双向调节因子也会促进细胞的增殖和分化，这些均对组织再生有着重要意义。
    在T细胞中，Th17和Treg的前体细胞均为CD4+T细胞。在促炎或抑炎的不同微环境中，CD4+T细胞可经TGF-β通路分化为Th17或Treg，二者分别对破骨细胞和成骨细胞具有一定调节作用，因而通过调控免疫微环境使二者达到平衡，对骨结合而言有重要意义，一定程度上代表了骨吸收与骨生成的平衡，而其失衡则会导致骨结合强度不足甚至结合失败。
    （4）肥大细胞与树突状细胞：在种植体植入后早期，肥大细胞首先通过脱颗粒释放组胺募集中性粒细胞和单核-巨噬细胞，开启局部的炎症反应。除此以外，肥大细胞还可释放包括VEGF、血小板衍生生长因子等细胞因子促进局部血管生成。
    有实验证明在修复骨缺损的过程中，肥大细胞的聚集早于新生血管形成，且使用色甘酸钠抑制肥大细胞活性后，成骨效果显著提升，说明肥大细胞可通过诱导纤维化相关血管生成抑制成骨。也有研究发现将肥大细胞释放介质与成骨细胞共培养后，培养基中形成的矿化结节数量显著减少，证明肥大细胞释放的多种介质的总体作用为抑制成骨。
    树突细胞作为一种抗原呈递细胞，是固有免疫和获得性免疫之间的媒介，其功能取决于其成熟程度，一般来说成熟树突细胞分泌IL-12、IFN-γ等促炎细胞因子，而未成熟树突细胞分泌IL-10等抑炎细胞因子，且树突细胞成熟过程受生物材料种类、表面亲水性等影响，有研究显示在多孔磷酸钙材料培养的树突细胞具备促进成骨细胞分化的能力。
    基于钛种植体的一项研究表明，通常认为具备较好促成骨能力的SLA表面会促进树突细胞的成熟，从而对成骨产生一定负面效果。因此，如何进行种植体的表面设计才能达到成骨效果的最大化，仍是需要解决的重要问题。
    3.通过种植体表面改性实现免疫调节
    近年来，由于种植体表面改性依旧不断变化，因此不同的表面处理也将影响免疫细胞的功能，进而影响免疫细胞对骨结合的作用。针对免疫细胞促成骨作用的表面改性已成为目前研究的热点。
    3.1种植体表面物理结构对免疫细胞的影响
    对种植体表面物理结构的改变体现在粗糙度和纳米结构上，一般认为粗糙度在1~2μm的种植体对于形成良好骨结合最为有利。目前应用比较广泛的SLA粗糙表面相较于光滑表面可增加血小板的黏附，并减弱后续促炎细胞因子的表达，从而促进骨结合进程。
    近期研究多聚焦于种植体表面不同形状和尺寸的纳米结构，有研究发现在直径为30nm的二氧化钛纳米管包覆的种植体周围可检出较多M2型巨噬细胞，包覆80nm二氧化钛纳米管的种植体周围M1型巨噬细胞较多，前者表现出更强的促骨基质矿化能力。且有研究表明，与IFN-γ/LPS刺激M1极化通过的RBP-J-IRF8通路不同，较大直径纳米管通过改变巨噬细胞形态激活FAK-MAPKs途径，从而促进M1极化。
    叶状纳米结构则表现出不同的特性，将表面覆盖不同直径和高度纳米叶的钛样品与巨噬细胞共培养后发现，直径为100nm、高度为300nm的纳米叶相较于其他直径更小而高度更大的纳米叶会抑制巨噬细胞黏附相关基因的表达，进而抑制NF-κB炎症信号通路中下游相关基因的表达，从而促进M2型巨噬细胞极化。此外还有关于纳米沟槽、纳米点等的研究都证明了不同的纳米形貌和大小对免疫细胞的影响。
    3.2种植体表面亲水性对免疫细胞的影响
    种植体亲水性可以用表面润湿性表示，亲水表面会影响种植体表面黏附的蛋白数量、种类并保留其原本空间构象。提高亲水性对于种植体骨结合的积极作用目前已形成共识，除对MSC及成骨细胞的直接作用外，亲水表面也可通过免疫调节促进骨结合。
    有研究表明亲水表面对白蛋白的吸附性高，导致抗炎细胞因子的分泌水平上升，巨噬细胞向M2方向极化；而疏水表面吸附更多的IgG2，通过补体途径增加了促炎细胞因子的表达，使巨噬细胞向M1方向极化。而一项针对树突细胞的研究发现，亲水表面的树突细胞一般保持在不成熟状态，分泌抑炎细胞因子，对骨结合有促进作用。
    3.3种植体表面成分对免疫细胞的影响
    通过在钛种植体表面附加涂层等方法可以改变种植体表面成分，将一系列生物因子、蛋白和金属离子等负载在种植体表面，从而实现对局部免疫微环境的调节。有学者通过聚多巴胺将IL-4直接黏附在钛种植体喷砂酸蚀（sand blasted and acid-etching，SLA）表面，相较于正常SLA表面，其周围可检出更多的M2型巨噬细胞和更高水平的抑炎细胞因子。
    也有研究在负载IL-4的TiO2纳米管钛表面包覆含RGD多肽的羧甲基壳聚糖水凝胶，利用RGD多肽增加MSCs的黏附，同时通过水凝胶降解后释放的IL-4调节局部免疫环境，促进其成骨分化。
    金属衍生物涂层也可通过免疫调节促进种植体骨结合，有学者利用醋酸钙制剂通过微弧氧化和水热结合的方法制备了TiO2/ZnO复合涂层，涂层中主要含有锌离子和钙离子，前者可提高IL-10分泌，后者可减低TNF-α分泌，两者协同作用达到抑制炎症，促进M2型巨噬细胞极化，提高成骨相关基因表达的目的。
    也有研究在钛基底上包覆由CaO/3CuO/4TiO2组成的直径为65nm的纳米粒子，该表面可缓慢释放铜离子，通过铜转运信号将巨噬细胞极化为M1表型，达到更好的抗菌效果，并可增强MSC的黏附和成骨分化，促进骨结合。
    4.总结与展望
    综上所述，要形成良好稳定的骨结合，重点在于通过调节免疫反应以达到最佳的成骨效果。但免疫调节的基本原则并非一味抑制炎症反应，而是通过控制炎症反应的时间和程度，在适当抑炎防止炎症反应对正常组织造成破坏和形成纤维包裹的基础上，为炎症细胞清除组织碎片，杀灭病原菌，促进血管生成和促进MSC成骨分化等提供充足的作用时间。因此，从免疫调节角度出发，种植体表面改性的未来方向是开发一种能时序性调控参与骨结合整个阶段的多种免疫细胞功能的新型表面，从而在时间和空间上实现免疫调节的精准化，以达到最迅速、最佳以及最持久的骨结合效果，缩短临床上种植体的愈合时间、提高种植体的成功率和远期留存率。