细胞外囊泡miRNA在口腔鳞癌中的研究进展

    OSCC是头颈部最常见的恶性肿瘤，在发展中国家恶性肿瘤发病率中排第9位。90%的口腔上皮源性恶性肿瘤为鳞状细胞癌，其常见于45岁以上成人，男性发病率高于女性。发病原因与生活方式、环境、基因相关。OSCC可发生在口腔任何部位，最常见于舌和口底。早期常无症状或症状不明显；晚期伴有区域淋巴结转移，可发生远处器官转移，严重降低患者生活质量。
    OSCC的临床治疗策略以手术为主、辅以放疗和化疗的多学科综合序列治疗。患者的5年生存率不乐观，仅为50%左右，发生转移者更低。OSCC患者预后差、生存率低部分原因是诊断不够及时，确诊时已为癌症中晚期或病变损害较严重的时期。
    有研究显示在OSCC晚期确诊（T3和T4或有淋巴结转移或远处转移）患者5年生存率约为30%，如果在T1阶段能够及时确诊并行有效治疗，其5年生存率可提升至80%。因此，研究者们希望寻找到一个高效的生物标志物和治疗靶标，以辅助OSCC的早期诊断和治疗。
近期，越来越多的研究表明细胞外囊泡（EVs）参与肿瘤的进展，是肿瘤微环境的重要组成部分，影响肿瘤上皮间充质的转化，诱导肿瘤细胞生长侵袭转移等过程。本文将对细胞外囊泡miRNA在口腔鳞状细胞癌中的研究进展做一综述。
    1.EVs及EVs中的miRNA
    EVs是一种由脂质双层膜结构包裹的细胞外囊泡。它可由多种细胞分泌，并释放到细胞外，介导细胞间的交流。在肿瘤细胞间转运致瘤蛋白、招募非转移性细胞构建肿瘤微环境，调节肿瘤细胞存活、生长、传播，介导调控肿瘤血管生成、调节免疫系统等。这种功能很大程度上是由EVs内蛋白质、脂质、核酸等物质介导的。
    MicroRNAs（miRNAs）是EVs中最常见的遗传物质，它是一种内源性非编码RNA，长度约18~24个核苷酸。miRNAs可以靶向mRNA调节基因的表达。其作为一个负向调节器，参与重要的细胞生物过程，以及肿瘤的发生发展，同样也对OSCC有着重要影响。
    1）EVs中miRNA影响OSCC生长
    肿瘤细胞释放大量EVs，通过EVs转运特异性miRNA，作用于受体细胞，激活各种信号通路，影响肿瘤细胞的生长。Dong等发现人脐带间充质干细胞可通过EVs转运miR-410，作用于肺癌细胞靶向PTEN，促进癌细胞的增殖Sento等报道OSCC细胞来源的EVs可通过活化PI3K/Akt、MAPK/ERK、JNK-1/2通路促进OSCC细胞增殖。Li等发现低氧诱导OSCC细胞后，miR-21的表达量升高，且OSCC细胞EVs中miR-21的表达量升高。EVs通过转运miR-21，促进OSCC细胞的生长迁移侵袭，诱导OSCC发生上皮间充质转化，促进转移前生物学行为。
    2）EVs中miRNA影响OSCC血管新生
    在肿瘤发生发展过程中，新生的血管为肿瘤的生长提供氧气和营养物质，并为肿瘤的转移提供条件。Zhang等发现单核细胞来源的EVs中miR-150-5p可促进血管内皮细胞的迁移，促进血管新生。Morioka等发现OSCC分泌的EVs可以转运至人脐静脉内皮细胞，调节血管内皮生长因子表达，诱导细胞生成管状结构，促进血管新生。
    Dickman等通过体内外实验发现OSCC来源的EVs中miR-142-3p特异性靶向TGFBR1通路，降低受体内皮细胞TGFBR1活性，诱导血管新生。
    3）EVs中miRNA影响OSCC侵袭
    EVs来源的miRNA在肿瘤的侵袭中也发挥着重要作用。在肝癌研究中，成纤维细胞来源的EVs可通过miR-335-5p抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。同样，在OSCC来源EVs中，miRNA影响肿瘤的侵袭。Kawakubo-Yasukochi等研究发现，在一个肿瘤组织中存在多种肿瘤细胞系，它们分泌的EVs中miRNA有所差别。
    高侵袭性OSCC细胞系EVs中致癌基因miR-200c-3p通过影响CHD9和WRN的表达，诱导肿瘤团块中非侵袭性OSCC细胞系的侵袭能力，以此影响肿瘤的侵袭。
    4）EVs中miRNA影响OSCC转移
    在OSCC中，约50%癌症患者晚期发生远处器官转移，导致预后不良。Fabbri等发现，肺癌EVs中miR-21结合免疫细胞Toll样受体，诱导Toll样受体介导的转移前免疫反应，促进肿瘤生长和转移。同样在OSCC中，Kawakubo-Yasukochi等研究发现，高转移性OSCC细胞系EVs促进低转移性OSCC细胞系的转移能力。
    Sakha等人的研究结果证实了这一点，他们发现高转移性OSCC细胞系中EVs中miRNA促进低转移性细胞系的转移。肿瘤细胞分泌EVs将miR-34、miR-1246转入到低转移性细胞中，直接靶向基因DENND2D（DENN/MADD Domain Containing 2D，DENND2D），促进肿瘤细胞侵袭和转移。
    5）EVs中miRNA影响OSCC免疫
    在免疫过程中，EVs通过转运miRNA进入免疫细胞，抑制特异性和非特异性抗原反应，抑制T细胞增殖分化，诱导调节性T细胞产生，参与肿瘤免疫调节。Ye等研究发现，头颈部鳞癌细胞来源的EVs高表达hsa-miR-24-3p、hsa-miR-891a、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-20a-5p和hsa-miR-1908，下调促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，调节T细胞增殖分化、导致T细胞功能障碍。这些肿瘤来源的EVs中miRNA调节T细胞功能，参与免疫逃逸过程，有望成为免疫疗法的靶标。在OSCC中，癌症患者血浆中的EVs含有更多的致癌性miRNA（如miR-21和miR-27），这些EVs被单核细胞吞噬后，通过激活NF-κB信号通路，影响肿瘤的免疫应答。
    2.EVs中miRNA的应用
    早期诊断、早期治疗、实时监测是控制癌症最有效的措施。EVs的脂膜包裹RNA可免受RNA酶的降解，比游离的RNA更加稳定，适合作为诊断OSCC的生物学标志物。同时，与OSCC相关的EVs及其转运的miRNA，因参与多种重要的肿瘤生物学活动，有希望成为治疗的靶标。
    1）EVs中miRNA用于OSCC诊断
    在诊断过程中，临床常用的组织活检技术有时会受各种条件的限制，无法实施。体液（如血液、尿液、唾液等）的内含物作为一种非侵入性的诊断标志物逐渐得到学者的注意。在OSCC患者血浆中，EVs携带致癌基因以及表面暴露分子，可用于肿瘤的早期诊断。多篇研究报道证实，恶性肿瘤患者唾液EVs中的miRNAs可作为肿瘤临床诊断及分型和分期的生物学标志物。
    LiL等发现，OSCC患者血液EVs中miR-21的表达量与正常人相比显著升高，且表达量与肿瘤大小以及是否有淋巴结转移相关。Langevin等认为头颈部OSCC患者唾液EVs中miR-486-5p、miR-486-3p以及miR-10b-5p可作为临床诊断生物学标志物。Rabinowits等发现在舌癌患者血浆和肿瘤组织中miRNA表达异常，且EVs中的miRNA比游离miRNA的表达量更接近于肿瘤组织中miRNA的表达量，表明EVs中的miRNA可作为舌癌诊断的生物学标志物。
    Wang等研究发现，口咽癌患者血清EVs中miR-21表达量的变化与肿瘤临床分期相关，且miR-21诊断口咽癌灵敏度和特异度较高，可作为诊断口咽癌的生物学标志物。Gai等通过生物芯片筛选唾液EVs中差异表达的miRNA，表明miR-412-3p和miR-512-3p可用于诊断OSCC。
    2）EVs中miRNA影响OSCC治疗
    EVs内含有各种脂质、蛋白、核酸等，参与肿瘤细胞和邻近细胞的交流，是药物的天然的载体，因此，可通过EVs包裹抑癌药物发挥治疗作用。越来越多的研究表明特定的EVs可以转运多种药物耐受蛋白和RNA至受体细胞中。Ohno等研究发现，可通过EVs转运修饰过的let-7a进入乳腺癌组织中，作用于表皮生长因子受体。EVs包裹修饰的miRNA有望成为一种核酸性治疗药物。
    同时，肿瘤来源EVs中miRNA可引起宿主的免疫反应，参与肿瘤治疗，因此EVs中miRNA可作为一个治疗靶标。另外，EVs还可介导OSCC的放化疗耐受。Liu等研究发现耐受顺铂的OSCC细胞系的EVs转运miR-21靶向PTEN和程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）诱导OSCC细胞顺铂耐受，为OSCC诊断和预后治疗提供价值。
    3.总结与展望
    在临床上，OSCC诊断大多依据临床症状和病理诊断结果。近年来，发掘与OSCC相关的生物标志物逐渐成为领域内的研究热点。有学者发现，miR-144-3p通过靶向EZH2癌基因而起到抑癌作用，可能成为OSCC潜在的诊断和治疗靶标。除miRNA外，癌胚抗原相关粘附分子6和基质金属蛋白酶-9被发现在口腔鳞癌中呈高表达，参与了OSCC的发生发展，可能为OSCC未来阶段的诊断、治疗、预后等提供重要依据。但目前仍然缺乏一个特异性强、灵敏度高、简单易行、安全可靠的生物标志物来辅助早期诊断，以更早地制定诊疗计划，提高患者的治疗效果，改善患者的预后和生存。
    体液中EVs的miRNA作为生物标志物有以下几方面优势：①EVs中的miRNA具有特异性，有特定的分拣机制，是一种选择性包裹和输出，并随着疾病的不同状态而发生变化。②人体血液、唾液中的EVs是miRNA的富集体，能提高miRNA扩增的灵敏度，同时提取EVs后减少了样本的复杂性，降低miRNA扩增出现阴性结果的概率。③囊泡的结构使miRNA免受RNA酶的降解，在体外也可以保存一段较长的时间。
    操作过程中，miRNAs也因其长度短较mRNA更容易提取鉴定，结果更加稳定。尽管目前有关EVs及miRNA在OSCC中的研究结果令人鼓舞，但miRNA在不同情况下的差异是今后研究中需要考虑的因素。许多研究表明，miRNA与衰老过程有关，且在老年人中常常被上调。这可能会影响OSCC患者中miRNA研究的稳定性，敏感性和特异性。另外，炎症与癌症发展相关，同样会影响miRNA的表达。造成miRNA的表达波动与癌症特征不直接相关，干扰miRNA的表达，降低研究数据的可再现性。
    另外，在O.Rapado-González等人评估血液和唾液miRNA在检测OSCC中的总体诊断准确性的meta分析中，单miRNA分析与多miRNA分析之间的诊断准确性分析结果没有明显差异。揭示了未来的研究应集中在多种miRNA的组合使用上，以研究其对诊断准确性的影响。同样，为了提高结果的可靠性且扩大覆盖范围，有学者建议将唾液miRNA和蛋白质组学数据结合起来研究。
    因此，未来研究中对于miRNA在OSCC中的诊断标准，需要更加灵活的考虑，以便最终适用于各种复杂的实际情况。各种体液中的miRNA是一种理想的生物学标志物，遗憾的是，目前在各研究中没有一致的miRNA用于肿瘤诊断，除了上述原因，性别、免疫状态、生活习惯也会影响miRNA的表达。EVs及其包含的miRNA的临床应用总体上也还在起步阶段，仅有树突状细胞来源的EVs作为肿瘤疫苗的研究已经进入临床实验阶段。所以，EVs中的miRNA作为诊断标志物仍需要大量实验研究和临床验证，以期找到一种或一组可以为OSCC诊断、治疗、预后提供参考的，适用于各种临床复杂情况的生物学标志物。