外泌体在口腔潜在恶性疾患诊疗中的研究进展

    口腔潜在恶性疾患（oral potentially malignant disorders，OPMD）是口腔黏膜病的重要组成部分，作为具有癌变风险的一类疾病，对其病因、诊断和治疗以及癌变风险评估相关分子标记物的研究备受关注。外泌体是一种具有生物活性的膜性囊泡，既可在细胞间传递活性物质，还可通过调控细胞间的信息传递参与细胞活动，在众多疾病的发生发展中发挥重要作用。本文对外泌体在OPMD诊疗中的作用进行综述，旨在揭示外泌体在OPMD发生和发展中的作用，为OPMD的防治开辟新思路。
    1.外泌体
    外泌体是由细胞分泌而来的微小囊泡，属于细胞外囊泡的一种，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。几乎所有类型的细胞（肿瘤细胞、免疫细胞、神经细胞、干细胞），都可以产生并释放外泌体。
    外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质、rRNA和microRNA，外泌体可通过细胞膜受体直接激活受体细胞，也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至细胞器进入受体细胞，参与细胞间通讯。
    外泌体在免疫应答、炎症反应、血管生成、凋亡、凝血和废物处理等生理过程发挥关键作用，不同细胞来源的外泌体所含有的RNA和蛋白成分不尽相同，可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。
    2.OPMD
    OPMD是指口腔黏膜上某些临床及组织细胞学已经有改变，并具有明显癌变倾向的疾病，上皮异常增生是其病理学特征，临床疾病包括口腔白斑病、口腔红斑病、口腔黏膜下纤维性变、口腔扁平苔藓、日光角化病、盘状红斑狼疮等。
    2005年，世界卫生组织口腔癌和癌前病变协作中心提出OPMD的概念，将所有具有癌变风险的临床表现统一划归为OPMD，涵盖了之前被归为口腔癌前病变和口腔癌前状态的所有疾病，以便更加准确地表述具有癌变潜能的口腔病损的特征和本质。多数OPMD病因复杂，发病和癌变机制不明，可能与复杂的细胞信号网络调控的稳态失衡有重要关联。
    据2020年美国癌症协会统计，美国新增口腔癌53260例，其中死亡病例10750例，对人们的生命安全和生活质量造成不良影响。超过90%的口腔癌为上皮鳞状细胞癌，其中OPMD是口腔上皮鳞癌的重要来源。
    3.外泌体在不同OPMD中的研究进展
    3.1口腔白斑
    口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）是口腔黏膜表面不能擦去的白色斑块或斑片，目前尚无根治方法，复发和癌变的阻断是口腔白斑治疗的两大难题。外泌体可介导细胞间通讯，并利用所含miRNA调节细胞的基因表达和表型，被认为与组织的癌变有关。
    研究显示OLK和口腔上皮鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）外泌体可以促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制抑癌基因p53的表达；微阵列分析得到OLK和OSCC组织来源的MSC外泌体中miR-8485表达增高，体外细胞实验显示miR-8485可促进肿瘤细胞的增殖、迁移，MSC释放外泌体在OPMD癌变防治中的意义。
    有研究分别比较了OSCC细胞、OLK细胞和正常角质形成细胞释放的外泌体对巨噬细胞表型的影响，发现OSCC细胞释放的外泌体可激活巨噬细胞，使其早期阶段极化为M1型巨噬细胞，同时其诱导的M1型巨噬细胞可反作用于OSCC细胞，促进OSCC细胞侵袭和转移。推测OSCC细胞释放的外泌体可能是通过血小板凝血酶蛋白家族THBS1蛋白，调控p38、Akt和SAPK/JNK信号传导发挥双向调节作用。而OLK和正常角质形成细胞释放的外泌体没有诱导巨噬细胞M1型极化能力。
    外泌体也有望用于OLK的治疗。已有实验表明，口腔颊癌组织中，miR-185的表达降低；miR-185可通过降低Akt水平和抑制Akt磷酸化调节肿瘤细胞的增殖和凋亡。有研究人员应用miR-185模拟物转染MSC来源的外泌体，获得高表达miRNA-185的MSC外泌体，将其黏贴于OLK动物模型的颊囊病损处，发现其可以减少病损处的炎症细胞浸润和炎性因子释放，并显著降低OLK组织异常增生的发生率。
    免疫组化显示MSC-外泌体-miR-185处理后病变组织中增殖标志物PCNA和血管生成标志物CD31的表达明显降低，而caspase-3和caspase-9水平增加。表明MSC-外泌体-miR-185可抑制异常增生细胞增殖和血管形成，并且诱导细胞凋亡，提示外泌体具有作为治疗OPMD的潜在价值。
    3.2口腔扁平苔藓
    口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是口腔最常见的慢性炎症性疾病，发病机制尚不明确，可能与自身免疫有关。研究表明外泌体与自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮等的发病存在相关性。
    有学者将来源于OLP患者血浆的外泌体与T细胞共同培养发现T细胞可以摄取外泌体，且发现虽然外泌体未能活化T细胞，但糜烂型OLP来源的外泌体可以增强T细胞的增殖、迁移能力，并降低T细胞的凋亡，但非糜烂型OLP却不能提高T细胞增殖，这也能部分解释糜烂型OLP的临床表现较非糜烂型严重。
    此外，研究发现OLP患者T细胞释放的外泌体可诱导T细胞分泌巨噬细胞炎症蛋白-1α/β，巨噬细胞炎症蛋白-1α/β可与CCR1/5受体结合，促进T细胞的趋化作用，从而影响OLP的发病过程。细胞研究显示外泌体有望成为评价OLP病情程度和病程进展的标记物，OLP患者血浆外泌体中miR-34a-5p表达增加，且与OLP病情严重程度正相关。此外，有学者应用miRNA微阵列和PCR技术发现OLP患者唾液外泌体中miR-4484含量显著上升。
    相较于组织活检等传统检验方式，通过检测唾液外泌体中miRNA的异常表达来推断疾病的发生发展，具有快速、简单、创伤小等优点，患者易于接受，具有较好的前景。也有学者将外泌体用于OLP的病因学研究。有研究认为OLP的发生发展与人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染有关。该研究发现OLP患者外周血白细胞中HCMV-DNA明显增多，同时血浆外泌体中HCMV编码的hcmvmiR-UL59显著升高，外泌体可保护hcmv-miR-UL59不被核酶降解。Hcmv-miR-UL59可作用于HCMV的UL16结合蛋白，从而调节自然杀伤细胞对病毒的免疫反应。
    3.3盘状红斑狼疮
    盘状红斑狼疮（discoid lupus erythematosus，DLE）表现为头面部皮肤和口唇黏膜散在、边界清楚的盘状红色斑块，研究认为DLE和系统性红斑狼疮属于红斑狼疮的不同亚型，都属于自身免疫性疾病。目前关于DLE和外泌体的相关性研究尚未见报道，但外泌体在系统性红斑狼疮发病机制方面已有研究。研究发现相较于健康人群，系统性红斑狼疮患者血清外泌体中miR-21和miR-155表达升高，而miR-146a表达降低。
    另一研究中发现miR-146a可被间充质干细胞摄取并通过TRAF6/NF-κB信号通路调控间充质干细胞老化，而骨髓间充质干细胞的异常老化在系统性红斑狼疮的发病中起重要作用。因此，外泌体有可能成为系统性红斑狼疮早期诊断以及预后的生物标记物。
    3.4口腔黏膜下纤维性变
    口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis，OSF）是咀嚼槟榔引起的口腔黏膜慢性进行性纤维化，其特征为口腔黏膜下胶原纤维异常沉积。目前暂无OSF与外泌体的相关性报道。然而有研究认为，外泌体可介导细胞间通讯，参与纤维化疾病的发生发展。如受损肝上皮细胞释放的外泌体可被成纤维细胞摄取，从而活化成纤维细胞，使成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原的表达增加，启动纤维化过程。而处于静止状态的肝星状细胞释放的外泌体可抑制活化型肝星状细胞的纤维化信号和结缔组织生长因子的表达。
    原代人成纤维细胞释放的细胞外囊泡可通过其携带WNT-5A蛋白促进成纤维细胞增殖。而特发性肺纤维化患者支气管肺泡灌洗液中细胞外囊泡的数量和囊泡内与WNT-5A表达增加，并可促进肺成纤维细胞增殖，可能与疾病的发病有关。此外，有研究发现心肌细胞释放的含有miR-208a外泌体可促进成纤维细胞的增殖，并促使成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。外泌体可能参与OSF的发生发展，但是其作用和机制有待进一步研究。
    4.总结
    外泌体作为细胞分泌的细胞外囊泡，根据其不同细胞来源，可有多种不同的功能；随着研究的深入，外泌体由于其独特优势，在用于疾病诊断和治疗方面有着很大的前景，外泌体也可帮助了解疾病的发生发展。然而如何将其用于临床，设定统一标准用于指导临床以及更加便捷、高效的提取体液中的外泌体，仍需进一步研究。