外泌体在口腔鳞状细胞癌恶性进展及诊疗应用的研究

    口腔癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，2018年全球因口腔癌死亡177 384例，占癌症总死亡的1.9%。口腔癌中，口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC） 所占比例超过80%。虽然放射治疗、化学治疗以及手术疗法已取得长足进步，但也存在较多不足，OSCC患者的5年生存率依然很不理想。
    晚期诊断、淋巴结转移和复发是OSCC患者不良预后和低生存率的主要原因。因此，寻找新的肿瘤生物标志物和靶向治疗的靶点对OSCC的早期诊断和临床治疗至关重要。随着癌症研究的深入，“种子和土壤”学说将人们的目光聚焦到肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME） 上。
    TME中，细胞间通讯是影响肿瘤进展的重要因素之一，而外泌体作为TME中细胞间通讯重要的信号载体，近年来备受关注。外泌体是指细胞在生理和病理条件下，经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成的膜性囊泡。
    外泌体通过介导特定的细胞间通讯，调节TME中的血管生成、免疫逃逸和远处转移，促进肿瘤的发生发展。研究证明：外泌体可用作液体活检或非侵入性生物标记物，也可作为药物的载体，用于疾病的早期诊断和治疗。本文主要论述外泌体在OSCC的研究进展，以期为攻克肿瘤治疗难题提供新的思路。
    1.外泌体的生物合成和功能
    在国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV） 首次会议上，当时学者们尚无法就囊泡命名法达成广泛共识，因此鼓励研究人员使用细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs） 作为不同类别分泌囊泡的通用术语。
    现阶段，通常将EVs分为两大类：外泌体（exosomes） 和核外颗粒体（ectosomes）。外泌体是指直径为30~150 nm核内体来源的带有脂质双层膜结构的细胞外囊泡。外泌体的具体形成机制尚不清楚，不同类型的细胞形成外泌体的过程类似，其形成过程主要在核内体中完成。
    细胞通过内吞作用将蛋白、mRNA、微小RNA （micro-RNA，miRNA）、脂质等物质内吞形成细胞膜包裹的内吞囊泡，小囊泡相互融合形成早期核内体，随后质膜内陷，胞质内的蛋白、miRNA、脂质等选择性地被包裹进囊泡结构；后期核内体产生许多小囊泡，并逐步演变成多泡体，多泡体转运至细胞膜与细胞膜融合，在Rab27a和Rab27b等Rab家族三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP） 酶的作用下协助释放到胞外形成外泌体。
    外泌体参与许多正常的生理活动，包括血管生成和骨愈合。外泌体在肿瘤的进展中也发挥重要作用，包括促进肿瘤血管生成、肿瘤转移前微环境的调控以及诱导TME中成纤维细胞的活化。
    病变器官中的异常细胞产生外泌体较正常细胞多，据研究，癌症患者的血液包含约4 000万亿个外泌体，约为正常人的2倍。根据外泌体在体液中分布广、数量多的特性，通过收集并分析体液中的外泌体，有助于为癌症的早期检测以及治疗新靶点的发现提供帮助。
    2. 外泌体在OSCC 交互中的作用
    长期以来，癌症研究多数仅仅关注肿瘤本身。随着“种子和土壤”理论的提出，TME的重要性被广大学者采纳。外泌体作为TME的重要组成部分，参与肿瘤增殖、侵袭以及血管生成，并通过抑制免疫监视和去除化学治疗药物以提高化学抗性来促进肿瘤生长和转移。由于外泌体在介导癌症恶性发展中的作用被发现得越来越多，因此近年来备受关注。
    2.1 外泌体介导OSCC细胞的增殖、迁移与侵袭
    随着肿瘤—基质相互作用机制的研究愈发深入，学者们逐渐发现基质细胞与肿瘤进展密切相关。成纤维细胞是癌症基质的主要成分，被肿瘤细胞活化的成纤维细胞称为癌相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）。CAFs作为TME的重要细胞之一，可通过多种机制参与肿瘤细胞的进展，其中CAFs通过旁分泌途径分泌外泌体影响肿瘤进展是近年来的研究热点。
    研究表明：CAFs来源的外泌体中包含的微纤丝关联蛋白5 （microfibrillar-associated protein 5，MFAP5） 通过诱导SCC25中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK） 和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt） 通路的激活，可显著提高SCC25细胞的恶性侵袭能力。
    CAFs中高表达的miR-382-5p可经外泌体转运至OSCC细胞，从而促进OSCC细胞的迁移和侵袭。此外，miR-34a-5p可通过与其直接下游目标AXL （AXL receptor tyrosinekinase） 结合以抑制OSCC细胞的增殖与转移。与正常成纤维细胞分泌的外泌体相比，CAFs分泌的外泌体中miR-34a-5p 的表达较低， 提示CAFs分泌缺乏miR-34a-5p的外泌体可能有助于OSCC的恶性进展。
    2.2 外泌体介导OSCC细胞的免疫作用
    外泌体在免疫促进和免疫抑制作用之间存在相互矛盾的机制。肿瘤来源的外泌体既可以刺激也可以抑制机体产生特异性和非特异性免疫应答。含有肿瘤相关抗原的外泌体可被抗原呈递细胞如树突状细胞（dendritic cell，DC） 有效吸收，从而产生抗肿瘤作用。
    此外，转移前肿瘤产生的外泌体，通过免疫监控引发广泛的先天免疫反应，可导致转移前生态位的癌细胞被清除。但有相关文献表明，外泌体参与了机体的免疫抑制作用，从头颈癌（head and neck cancer，HNC）患者血浆中分离获得的外泌体可有效诱导CD8+ T细胞的凋亡，抑制CD4+ T细胞的增殖，增强调节性T细胞（regulatory cells，Tregs） 的免疫抑制能力以及抑制自然杀伤（natural killer，NK） 细胞的细胞毒性。
    肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophages，TAMs） 是TME中最丰富的免疫细胞之一。TAMs在肿瘤的增殖、迁移以及血管生成方面起着关键作用，并且可以抑制T淋巴细胞和NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，从而促进肿瘤细胞逃避免疫监视。TAMs具有很强的功能可塑性，可分别获得免疫刺激（M1样） 或免疫抑制（M2样）能力，以及介于两者之间的各种功能表型。
    OSCC细胞系（SCC-9和CAL-27） 来源的外泌体中的miR-29a-3p通过激活细胞因子信号转导抑制因子1（recombinant suppressors of cytokine signaling 1，SOCS1） /信号转导子和转录激活子6 （signal transducers and activators of transcription 6，STAT6） 信号途径诱导巨噬细胞发生M2样改变，并且这种M2样TAMs能促进SCC-9和CAL-27细胞的增殖和侵袭；同时，含有miR-29a-3p的外泌体能够促进裸鼠体内OSCC的生长。
    Xiao等发现：来自OSCC细胞的条件培养基能激活巨噬细胞成为M1样TAMs，并提出了基于OSCC来源的外泌体形成的一种癌细胞和巨噬细胞间的新型旁分泌环——即巨噬细胞通过摄取OSCC细胞来源的外泌体，经p38、Akt 和应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase， SAPK） /c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）信号转变为M1样TAMs，其中OSCC来源外泌体中的血小板反应蛋白（thrombospondin 1，THBS1）参与了巨噬细胞的活化过程，M1样TAMs来源的外泌体再对OSCC细胞产生促进作用。TME的缺氧应激通常被认为是肿瘤来源外泌体发生变化的原因。
    有研究发现：常氧环境中，OSCC来源的外泌体以依赖热休克蛋白70 （heatshock proteins 70，HSP70） 但不依赖DC的方式促进γδT细胞的增殖和肿瘤杀伤能力；但在缺氧环境中，OSCC来源的外泌体对γδT细胞的刺激作用消失，并且骨髓来源的抑制性细胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs） 摄取OSCC来源的外泌体后通过调控miR-21/PTEN （phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10） /程序性死亡受体-配体-1 （programmed death ligand 1，PD-L1）轴抑制γδT细胞的活性，逆转常氧环境中外泌体的免疫促进作用。这为外泌体的免疫促进和免疫抑制作用之间的矛盾提供一个可能合理的解释，其具体机制还需进一步探讨。
    2.3 外泌体介导TME中血管的生成
    外泌体还参与病理性血管生成的调节，包括肿瘤血管生成。血管的生成依赖于内皮细胞，并借此为癌细胞提供氧气和营养。内皮细胞通过摄取肿瘤来源的外泌体促进其增殖和迁移，并借此诱导肿瘤组织中的血管生成。
    来源于SCC-15的外泌体通过诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC） 的增殖及迁移，发挥了明显的促血管生成作用。此外，头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma， HNSCC） 细胞系PCI-13和UMSCC47来源的外泌体能够携带大量血管生成相关蛋白，如凝血因子Ⅲ、重组人胰岛素生长因子结合蛋白-3、尿纤溶酶原激活物和血小板反应蛋白1等，并通过诱导HUVEC的功能重编程以及促进癌细胞对于HUVEC的黏附力，成为OSCC TME中血管生成的有效诱导剂。
    2.4 外泌体介导OSCC的化学治疗耐受
    尽管化学治疗在OSCC治疗中取得了长足进步，但肿瘤的耐药性仍是其治疗失败的主要原因之一。研究发现，外泌体通过多条信号通路创造了有利于耐药的TME。耐受顺铂的OSCC来源的外泌体中miR-155存在过表达，而过表达的miR-155可通过调节上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和下调FOXO3a （forkhead box O3a，FOXO3a） 赋予OSCC顺铂耐药性。
    另外，有研究发现：顺铂耐药OSCC细胞的条件培养基能增强亲代OSCC细胞的耐药性；进一步研究可知，来自顺铂耐药的OSCC细胞的外泌体通过将miR-21转移至OSCC亲代细胞，调控PTEN和程序性细胞死亡因子4（programmed cell death factor 4， PDCD4）表达，从而诱导亲代细胞对顺铂产生耐药。在体内模型中，该结果得到验证。
    与顺铂敏感品系OSCC细胞系H103相比，顺铂耐药品系H314来源的外泌体以及其培养基中均含有更高浓度的顺铂，提示抑制外泌体分泌可能起到降低顺铂外排的作用；在使用质子泵抑制剂抑制了OSCC的外泌体分泌后，观察到H314细胞的药物敏感性增加，表明外泌体可能在OSCC耐药性中起着药物外排的作用。由此可以推测，控制外泌体的分泌可能是增强癌症治疗功效的潜在策略。
    3.外泌体在OSCC诊断和治疗中的临床应用
    由于外泌体携带重要的生物分子，并且广泛存在于体液中，因此其在癌症的早期诊断、预后和治疗中具有巨大的临床应用潜力。此外，外泌体作为miRNA和治疗剂转移至靶细胞的药物递送载体，与合成载体相比，这些纳米囊泡具有更高的安全性和稳定性，这为癌症治疗中的靶向药物输送提供了可能。
    3.1 外泌体在OSCC诊断中的应用
    OSCC晚期诊断仍然是其高发病率和高死亡率的主要原因之一。大多数OSCC发展至晚期临床阶段才被确诊，组织学检查是OSCC诊断的“金标准”。研究证明：唾液活检有可能被用于口腔癌患者的诊断，以及作为评估预后的生物学标志。
    唾液收集无创，患者的依从性更高，唾液中miRNA表达谱与血液相似，且唾液相对于血液具有不凝结的优势。存在于唾液中的外泌体，其内含蛋白质、miRNA和mRNA等生物学信息，具有脂质双层膜的保护能免于降解，另外获取外泌体又是一种无创的方法，综合这些优点，收集并分离唾液外泌体为口腔癌的早期诊断提供了新的可能。与健康人的唾液外泌体（67.4 nm±2.9 nm）相比，口腔癌患者的唾液外泌体（98.3 nm±4.6 nm）更大，且口腔癌患者唾液中的外泌体密度增加了2~4倍，囊泡间聚集度更高，呈聚集的囊泡或成簇状，形态上的差异更大。
    临床研究发现：与健康个体和口腔溃疡患者相比，OSCC患者唾液中的外泌体数量明显升高，通过相关性分析发现，唾液中外泌体的数量与OSCC患者的临床病理特征呈正相关。He等发现：与健康个体相比，OSCC患者的唾液外泌体中miR-24-3p含量更高；与肿瘤周围组织相比，miR-24-3p在OSCC组织中表达显著升高，且miR-24-3p可通过直接与昼夜节律蛋白1 （periodcircadian protein 1，PER1） 相互作用显著促进OSCC细胞的增殖，表明唾液中的miR-24-3p可能起源于肿瘤细胞。唾液外泌体中miR-31在OSCC患者唾液中的含量亦明显高于健康个体；而在切除肿瘤4~6周后，86%患者唾液外泌体中miR-31的水平显著下降。
    由此可以推测，外泌体中miR-24-3p和miR-31可能是OSCC早期诊断较为理想的指标。将唾液外泌体作为未来OSCC临床常规生物检测标志物，将有助于癌症的早期诊断、早期预防和针对性的靶向治疗，也可改善OSCC患者的治疗效果，减少化学治疗的不良反应。
    3.2 外泌体在OSCC治疗中的应用
    随着靶向药物的不断发展，纳米技术为靶向输送和控释药物带来了广阔的前景。现阶段各种药物纳米制剂仍存在两个问题：纳米毒性和单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocyte system，MPS） 的快速清除。外泌体可能同时具有合成纳米载体和细胞介导的药物输送的优势，并可避免与合成载体相关的快速清除和纳米毒性；此外，外泌体在TME中具有与受体细胞独特的交互能力，根据外泌体特征、来源和特定的细胞向性，可对特定的组织和器官进行药物输送。
    因此，越来越多的研究将外泌体作为高效的靶向药物载体，来运送低相对分子质量的治疗剂，如核酸和蛋白质。经体内外研究发现：含有miR-138的γδT细胞的外泌体通过降低S和G2/M期CAL-27细胞的积累，增加G1期细胞的数量，从而直接抑制肿瘤生长；含miR-138的γδT细胞的外泌体又能显著提高CD8+ T细胞的增殖能力，诱导γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ） 的产生以及增强CD8+ T细胞对肿瘤的杀伤作用。由于含有miR-138的γδT细胞来源的外泌体对OSCC的直接抗肿瘤作用，以及对T细胞的免疫刺激作用，可考虑将富含miR-138的γδT细胞来源的外泌体作为OSCC治疗的候选药物。
    miR-101-3p可从人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells， hBMSCs）经外泌体途径转移到受体TCA8113细胞内，显著抑制TCA 8113细胞的侵袭和迁移；小鼠移植瘤模型显示：注射了含miR-101-3p外泌体的裸鼠，其肿瘤体积和重量明显减小；这些结果均提示，含miR-101-3p的外泌体能够抑制OSCC的进展。
    有学者从临床中分别分离并研究了正常口腔黏膜、口腔白斑和口腔癌组织中的间充质干细胞来源的外泌体的差异，结果显示：与正常口腔黏膜相比，口腔白斑和口腔癌来源的外泌体具有更强的促进SCC15增殖、迁移和侵袭的能力；在小鼠模型中也得到了同样的结果。
    另外，与正常口腔黏膜相比，miR-8485在口腔白斑和口腔癌分泌的外泌体中表达水平更高，且外泌体中的miR-8485能够促进SCC15的增殖、迁移和侵袭。从该研究可以看出：干预间充质干细胞来源的外泌体的分泌可能是抑制癌变进展的一种新策略。
    4.小结
    随着外泌体在OSCC中作用机制的研究日渐深入，外泌体作为TME中细胞间通讯不可或缺的角色备受瞩目。外泌体通过重塑TME，改变基质细胞的表型，从肿瘤的生长、转移、免疫调节和血管生成等方面影响肿瘤的发展。外泌体是一类广泛存在于人类体液中的纳米级囊泡，由于其稳定的脂质双层膜结构和特殊的细胞向性，使其可能成为精准医学的新型生物标记物和高效的药物载体，为恶性肿瘤患者带来福音。
    但是，目前大多数的研究仍集中在体外研究和动物实验阶段，依然有很多不明确的效应及机制，且缺乏临床试验验证。外泌体用于OSCC的诊断和治疗，还有很漫长的路要走。随着更深入理解外泌体的特征、生物合成、功能以及外泌体与肿瘤细胞间的交互作用，将外泌体作为新的肿瘤诊断方法，帮助评价预后和治疗效果，以及作为靶向药物递送的载体，从实验室走向临床，将会是今后努力探索的方向。