口腔鳞状细胞癌中上皮-间充质转化相关影响因素的研究进展

    口腔恶性肿瘤是世界上常见的恶性肿瘤，在口腔癌中，约90%的患者为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），严重威胁着人类健康。尽管近几年在OSCC的预防、诊断和治疗等方面取得了很大进展，但许多患者仍因转移和复发而死亡。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肿瘤研究方面成为新的研究热点，很多学者认为，EMT是肿瘤发生侵袭转移的关键步骤。
    1.EMT概述
    EMT是在物理、化学和生物等因素的影响下，上皮细胞获得了间充质细胞的表型，在此过程中上皮细胞发生极大程度的变化，包括细胞极性消失，细胞骨架、细胞黏附力下降，并且获得了侵袭、抗凋亡等生物学特性。
    根据在生物学行为中的作用，把EMT分为三种类型:一类表示上皮细胞向运动间充质细胞转化的发育过程阶段；二类涉及到伤口愈合和组织再生，即在损伤和慢性炎症过程中由上皮细胞产生成纤维细胞；三类EMT发生在上皮性癌细胞中，提示癌症的进展和转移。在第三类中，EMT涉及E-钙黏蛋白、α-连环蛋白、紧密连接蛋白、闭合蛋白和细胞角蛋白等上皮标志物的缺失，以及N-钙黏蛋白、波形蛋白等间充质标志物的增加。
    1.1E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）
    E-cad作为钙黏家族的重要成员之一，具有介导细胞间黏附和帮助保持上皮组织及结构完整性的功能。基因突变、启动子的高甲基化以及转录抑制均可以导致E-cad的丧失，从而诱导EMT。
    1.2N-钙黏蛋白（N-cadherin，N-cad）
    N-cad也是钙黏家族的重要成员之一，在肿瘤侵袭和转移过程中，N-cad作为间充质标志物与上皮标志物E-cad组成钙黏蛋白的开关（E-cad的缺失常常伴随着N-cad表达的增加），被认为是肿瘤进展和转移的关键机制。N-cad的表达增多有助于细胞向更具活跃性、侵袭性和转移性的细胞表型转化。
    1.3波形蛋白（Vimentin）
    Vimentin是一种细胞骨架蛋白，在正常的上皮细胞中没有表达，但在间充质细胞中表达，如成纤维细胞、内皮细胞和淋巴细胞。研究证明Vimentin的高表达可能是OSCC淋巴结转移的危险标志物。
    在一项OSCC的研究中发现，E-cad的表达与Vimentin的表达呈负相关，猜测可能是Vimentin的表达降低了E-cad的表达，从而增加了癌细胞的迁移和侵袭能力。
    2.影响EMT的相关因素
    EMT是一种复杂的现象，受到不同的细胞因子、信号通路、RNA以及病毒微生物和微环境的影响，这些因素构成一个庞大而纵横交错的调控网络。这些影响因素之间有的互相拮抗，有的互相协同，对OSCC中EMT的发生发展起到了至关重要的作用。
    2.1影响EMT的细胞因子
    2.1.1表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）
    EGFR是一种具有酪氨酸激酶活性的膜表面传感器，能调控正常细胞的增殖、侵袭以及血管生成。早前就有研究表明EGFR能通过糖基化修饰而稳定EGFR的表达、促进EGFR下游信号传导，从而促进OSCC中肿瘤细胞的迁移。抑制EGFR信号传导已成为一种治疗OSCC的策略，西妥昔单抗（cetuximab）对EGFR的表达有抑制作用，通过EMT和Akt/Erk途径，从而抑制OSCC的生长、侵袭、血管生成和转移。
    2.1.2转化生长因子（transform growth factor，TGF）
    TGF-β是一种具有多功能生物活性的细胞因子，它已被证明具有矛盾的两面性。在早期肿瘤细胞中，TGF-β抑制细胞增殖，促进细胞凋亡；在晚期，TGF-β通过E-cad的减少、N-cad的增加使肿瘤发生EMT，从而诱导了肿瘤的侵袭和转移。研究发现，TGF-β信号可能与长链非编码RNA（lon gnon-coding RNAs，lncRNAs）相互作用，促进或抑制肿瘤的发展，如MIR4435-2HG可以通过TGF-β调控癌细胞的行为。
    2.1.3肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）
    TNF-α可以调控体内多种生理过程，包括致癌基因的活化、DNA的损伤和促进肿瘤的发展。最早在乳腺癌中，TNF-α通过激活细胞内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK激酶）通路诱导EMT已被研究者们证实。ZHAO等人发现在OSCC中抑制MAPK信号通路可降低TNF-α促进EMT发生的能力，从而降低了肿瘤的侵袭转移；而LEE等人又发现TNF-α通过核转录因子-κB（NF-κB）信号通路，抑制癌症发展过程中癌前或转化细胞的死亡，从而促进肿瘤发生。此外，TNF-α可调控转录因子Snail的稳定表达，诱导OSCC发生EMT，TNF-α-NF-κB-Snail通路成为了肿瘤中的研究热点。
    2.2影响EMT的信号通路
    2.2.1PI3K/Akt信号通路
    磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信号通路在调节细胞增殖和维持恶性细胞生物学特性方面起着重要作用。Akt是PI3K下游的直接效应分子，PI3K/Akt信号通路通过与其他信号通路直接或间接协作来诱导EMT，这导致了肿瘤的抗细胞凋亡、增殖、侵袭、转移及化疗耐药性增强。
    2.2.2Notch信号通路
    Notch信号通路被广泛研究，能够参与细胞生长和发展的多个方面，包括增殖、细胞凋亡和转移。在OSCC的EMT过程中，g-分泌酶抑制剂（DAPT）可阻断Notch信号，信号的抑制明显降低了Snail和Vimentin的表达水平，增加了E-cad的表达，抑制了癌细胞的侵袭。
    在最新的研究中发现，核因子相关因子2（Nrf2）信号通路可激活Notch信号通路，共同促进EMT的发展；碱性磷酸酶（ALP）在OSCC中上调miR-211-5p表达并使Notch通路失活，为治疗提供了新的指导方向。
    2.2.3Wnt信号通路
    由于Wnt配体和受体的种类繁多，Wnt信号级联通路包含几个不同的分支:Wnt/β-catenin（或称经典Wnt信号传导途径），平面细胞极性（Wnt-PCP）途径和Wnt钙信号传导途径。E-cad、Vimentin、腺瘤性息肉病（APC）、Snail、N-cad均与Wnt信号通路有一定的关联。HOXC10作为HOX基因家族的一员，显著提高了癌细胞的增殖、侵袭和转移，在OSCC中敲除HOXC10，抑制了N-cad、Vimentin和Snail表达，增加了E-cad水平；细胞研究进一步证实，HOXC10可以通过调节Wnt信号通路来促进OSCC的侵袭和转移。
    2.3影响EMT的RNA
    2.3.1微小RNA（microRNAs，miRNAs）
    miRNAs是一类大小为17~25个核苷酸的小型内源性非编码RNA，它通过与信使RNA（messenger RNAs，mRNAs）的3'-未翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）杂交来调节许多基因及蛋白的表达。由于在肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、生存、运动、侵袭及转移中起着关键作用，越来越多的miRNA被认为是肿瘤进展中的关键转录后调节因子。
    有一些miRNA具有促进肿瘤生长的作用，miR-134在口腔癌中的致癌作用是通过降低程序性细胞死亡7（programmed cell death 7，PDCD7）和E-cad的表达来介导的；miR-92a作为促进OSCC生长的miRNA，可以与Kruppel-likefactor4（KLF4）基因的3'-UTR结合，沉默miR-92a通过靶向KLF4，失活了Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制了OSCC细胞增殖，促进凋亡。
    而有一些miRNA具有抑制肿瘤生长的作用，miR-638可以通过靶向磷脂酶D1（phospholipaseD1，PLD1）抑制Wnt/β-catenin通路，从而实现其在OSCC中的抗肿瘤作用；miR-103过表达通过负调控SALL4，抑制了OSCCTca8113细胞的增殖和侵袭，也抑制了MMP-9、MMP-2和Vimentin的表达，增加了E-cad的表达，从而抑制了EMT的发生。
    2.3.2长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）
    lncRNAs是指长度超过200nt且缺乏蛋白质编码能力的RNA转录本。许多lncRNAs在癌症发展过程中存在异常调控。虽然lncRNAs不参与蛋白的合成，但它们能够调控癌基因和抑癌基因的表达，促进或抑制癌症的发生发展。
    lncRNAHOTAIR作为一种竞争性内源性RNA，敲除它显著降低了体外OSCC细胞的迁移、侵袭和EMT。它能有效地覆盖miR-326，从而调节转移相关基因2（metastasis-associated gene 2，MTA2）的抑制；lncRNAGAS5通过调节miR-21/PTEN轴，抑制了OSCC的增殖、迁移、侵袭和EMT；在OSCC组织中，lncRNALINC00958表达上调，并在体外功能获得和损失实验证明，LINC00958可促进OSCC细胞生长、延缓细胞凋亡、加速EMT转化，此外，学者们发现LINC00958可通过miR-627-5p/YBX2轴促进OSCC的进展。
    2.4影响EMT的细菌病毒微生物
    2.4.1牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）
    P.gingivalis是革兰阴性厌氧菌，为牙周炎的主要致病菌，具有较强的感染和破坏牙周组织的能力。LEE等人首次发现P.gingivalis可诱导原代口腔上皮细胞（oral epithelial cell，OEC）向间充质细胞转化，使细胞中的Vimentin、MMP-9、Snail和Slug升高；E-cad减少，激活EMT，促进OSCC的迁移和侵袭。该菌还能激活经典信号通路PI3K/Akt，活化的Akt通路可激活NF-κB的表达，NF-κB参与了抗凋亡、促进血管再生和肿瘤细胞入侵，来诱导EMT的发生。
    2.4.2疱疹病毒（Epstein-Barr virus，EBV）
    LMP1是EBV主要的原癌蛋白，可激活NF-κB、PI3K/Akt和MAPK等多个信号通路，参与EMT的诱导。近年来，越来越多的证据表明LMP1可下调E-cad的表达，并促进E-cad到N-cad的转换；刺激MMP-9的表达，促进细胞生长，增强细胞活性和刺激血管生成。另外，有证据指出人乳头瘤病毒（human papilloma viruses，HPVs）会诱导OSCC细胞发生EMT。
    2.5影响EMT的微环境
    2.5.1低氧
    低氧会引起细胞代谢的改变，并引发不同的分子反应。这些反应促进肿瘤进展，激活EMT相关信号通路，赋予肿瘤放射抵抗和化疗抵抗的能力。吴泽键等人研究证明在低氧环境下培养人舌鳞癌细胞SCC9、CAL2748h后，Vimentin在蛋白和mRNA水平均显著升高，E-cad表达降低，缺氧诱导因子（hypoxia inducible factors，HIFs）表达上调，细胞迁移能力显著增强。
    2.5.2pH
    pH的改变可以影响细胞的增长和迁移能力。NAKASHIMA等人研究发现在人OSCC细胞中，敲除苹果酶（malic enzyme1，ME1）和乳酸脱氢酶A或抑制丙酮酸脱氢酶（PDH）可抑制乳酸发酵，乳酸分泌减少导致细胞外pH值升高，EMT被抑制；相反，当氧化磷酸化被PDH敲低抑制时，乳酸分泌增加，细胞外pH降低，酸性诱导EMT的产生。证实了pH与EMT具有相关性。
    3.展望
    癌症复发和转移是导致OSCC死亡人数增加的主要原因，许多研究结果表明，EMT在OSCC的发生发展中占主要步骤。在本文中，我们总结了在OSCC中EMT发生时相关蛋白的具体表现以及影响EMT的各种因子、通路、RNA、细菌病毒微生物和微环境。预计将来会发现更多调控EMT的因素，但是如何更早的发现EMT的发生，发现后又如何阻断这些相关因素对EMT的影响，以及如何将所研究的靶点运用在临床中等问题接踵而至。因此，对EMT的进一步深入研究，将有利于从早发现出发设计药物，阻断早期癌症患者的肿瘤转移，提高疾病诊断率和患者生存率。