〔摘要〕 目的：检测成釉细胞瘤中的BMP的表达，探讨成釉细胞瘤的发生及病理机理。方法：采用免疫组化和原位杂交的方法，检测24例成釉细胞瘤标本中BMP蛋白和BMP-2 、-4 mRNA表达。
结果：成釉细胞瘤中的柱状上皮层和星网状细胞层中均有BMP-2 、-4 mRNA和BMP蛋白的表达，BMP-2、-4 mRNA的杂交信号强度在柱状上皮层小于星网状细胞。结论：BMP的表达为探讨成釉细胞瘤的来源提供了分子基础；BMP可能参与了肿瘤病理机理及生物学行为的形成。
关键词 骨形成蛋白；成釉细胞瘤；信使RNA
成釉细胞瘤是颌骨肿瘤中比较常见的一种，生长具有侵袭性，术后易复发，有少数可以发生恶性变或远处转移。骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins, 简称BMPs）除BMP-1外，其它均属于TGF-β超家族。BMP-2 和BMP-4与许多骨肿瘤的临床和预后密切相关，但对于BMP-2、-4在颌骨成釉细胞瘤中的表达及其作用目前还不清楚。本实验应用BMP的单克隆抗体及BMP-2 和BMP-4的cDNA探针，对成釉细胞瘤中的骨形成蛋白进行蛋白和mRNA 水平的检测，以帮助探讨其发生机理及病理机理。
1 材料和方法
1.1 标本来源 所有标本来源于第四军医大学口腔医学院病理科（1996 ～1997 年），标本总例数为24例。上颌骨标本8例，下颌骨标本16例，平均年龄48岁。标本由体积分数(φ)为10％的福尔马林液固定，常规石蜡包埋，连续组织切片，厚度5 μm。
1.2 免疫组化 bBMP-MCAb由本实验室制备，工作浓度为1∶50 ，ABC试剂盒购自Vector公司。常规免疫组化方法染色，DAB显色。设已知有BMP表达的骨肉瘤标本作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 原位杂交
1.3.1 探针的制备 重组质粒PSP64-BMP-2由美国基因研究所Dr Wozney 馈赠，bluescript sk-BMP-4由美国得克萨斯大学Feng Jianquan 教授馈赠。将上述重组质粒转化感受态细胞（PSP64-BMP-2的宿主菌为GM109，bluescript sk-BMP-4的宿主菌为XL1-blue），经扩增、质粒提取及酶切鉴定后，参照地高辛标记检测试剂盒（德国 Boehringer Mannheim 公司）说明对探针行随机引物法标记。
1.3.2 原位杂交检测 切片经梯度酒精处理入DEPC水及0.1 mol/L的PBS，0.2 mol/L HCl和蛋白酶K处理（20 mg/L），2g/L的甘氨酸终止反应，40 g/L 的多聚甲醛固定，经0.1 mol/L PBS洗后梯度酒精脱水、室温干燥，探针（2 mg/L）97 ℃变性10 min后杂交（42 ℃，20 h）。切片分别用2×SSC、1×SSC、buffer 1、buffer 3洗，正常羊血清封闭30 min后，以标记碱性磷酸酶的地高辛检测系统检测。实验设去除探针的空白对照和经RNA酶处理的消化对照，阳性对照为经过反复检验的骨肉瘤标本。
2 结 果
2.1 提取质粒DNA酶切鉴定 PSP64-BMP-2由3.0 kb的载体和1.58 kb的BMP-2 cDNA组成，bluescript sk-BMP-4由2.96 kb的载体和1.8 kb的BMP-4 cDNA组成。分别经碱裂解方法提取的质粒DNA经ECORI酶切后得到两个片断，与λDNA/HinIII marker 比较后，确定含有BMP-2和BMP-4的cDNA片断。
2.2 免疫组化检测结果 BMP的阳性反应为胞浆的棕黄色着色或表现为基质黄染。24例成釉细胞瘤中均可见BMP阳性反应，阳性反应位于肿瘤细胞的胞浆中。在滤泡型的肿瘤中，柱状上皮可见较强的BMP阳性反应，星网状层细胞中可见散在的阳性反应细胞（图1）。
图1 免疫组化法，成釉细胞瘤胞浆显示BMP阳性 ×200
2.3 原位杂交检测结果 BMP-2和BMP-4的杂交阳性标准为细胞浆中的深蓝色的细颗粒。24例原位杂交成釉细胞瘤标本中均可见阳性杂交信号。略去探针的空白对照未见阳性信号，RNA酶消化后阳性信号明显减弱。BMP-2和BMP-4 mRNA阳性信号的分布及强弱基本相似。在滤泡型的肿瘤中，在柱状上皮层细胞及不规则的星网状细胞胞浆中均有BMP-2和BMP-4的mRNA的扩增表达，但阳性杂交信号表达的数量及强度在柱状上皮细胞层低于星网状细胞（图2，3）。纤维组织基质及角化细胞中无阳性信号。
