涎腺多形性腺瘤p53基因突变的聚合酶链式反应--单股构型多态分析研究

　　【摘要】　目的　检测涎腺多形性腺瘤中p53基因突变。方法　采用非同位素聚合酶链式反应--单股构型多态分析(PCR-S SCP)技术对涎腺多形性腺瘤进行研究。结果　14例多形性腺瘤中有11 例出现PCR-SSCP异常电泳带(阳性率78.6%)。突变部位分布在第5～8外显子，其中第5、 6、7、8外显子的阳性例数分别为2、6、7、3例。在11例阳性肿瘤中有2例肿瘤同时出现3对 外显子(第6、7、8外显子)异常；3例肿瘤同时出现2对外显子(第6、7和7、8外显子)异常。 结论　①涎腺多形性腺瘤发生中p53基因的第5～8外显子均有突变， 其中突变频率最高的是外显子6和7；②在阳性的肿瘤中约有半数出现多位点突变。
　　【关键词】　多形性腺瘤　　基因　　突变　p53　　PCR-SSCP

　　大多数上皮源性肿瘤p53基因点突变是最常见的突变方式［1， 2］。为确定涎腺多形性腺瘤中p53基因突变的方式和位点，应用非同位素PCR-SSCP方法对 多形性腺瘤进行研究。

材料和方法

　　一、标本：取自近期手术切除的涎腺多形性腺瘤14例，正常腮腺组织2例。所有新鲜标本立即经-196℃液氮速冻15分钟，置-70℃冰柜存放。
　　二、DNA提取：取100mg新鲜冷冻组织，剪碎后置研磨器内，加入1ml DNA提取液(100mM NaCl；10mM Tris-HCl;25mM EDTA;0.5%SDS)，冰水中研磨组织成匀浆，吸入1.0ml Eppendrof管中，加入40μl蛋白酶K(10mg/ml)。50℃～55℃水浴4小时(或37℃水浴过夜)。取出Eppendrof管置4℃冰箱。加入等体积饱和酚，摇荡10分钟，离心5000rpm，5分钟。取上清液，加入等体积饱和酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，振荡5分钟，离心5000rpm，5分钟。取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(24/1)，振荡5分钟，离心5000rpm，5分钟。取上清液加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，逐渐加入二倍体积的冰无水乙醇。出现白色絮状物后，吸出置另一干净 Eppendrof管内，加入少量80%乙醇，离心，倒掉乙醇，置4℃冰箱凉干。TE溶解，置-20℃冰 箱保存。
　　三、聚合酶链式反应(PCR)：①引物设计：p53基因点突变主要位于4个保守区，即外显子5、 6、7、8。4对引物分别扩增了含有易突变位点的p53基因的4个DNA片段。引物序列见附表。 ②PCR扩增：PCR反应体系(25μl)中模板DNA 2μl(300ng/μl)，4×dNTP 2μl(2.5mM/μl)，10×PCR缓冲液2.5μl(含MgCl 15mM/ml),引物P1和P2各0.5μl(86μg/μl)，无菌三蒸水17μl。95℃水浴变性5分钟后加入Taq DNA聚合酶0.5μl(3U/μl)，充分混匀，加矿物油(美国Sigma公司)1～2滴。DNA扩增仪(美国PE公司480型)内40次循环(94 ℃变性1分钟，55℃退火1分20秒，72℃延伸2分钟)，反应完成后，取5μl PCR产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

附表　p53基因PCR扩增引物序列
 

　　四、单股构型多态分析(SSCP)：取5μl PCR产物，加入 5μl SSCP上样液(95%去离子甲酰胺，20mM/L EDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯晴 蓝)，混匀。98℃变性8分钟，冰水骤冷，立即上样进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰 胺：甲基丙烯酰胺=60：1)，1×TBE为电泳缓冲液，50V，30mA恒电流电泳8～10小时，电泳 至溴酚蓝接近凝胶底部时结束。
　　五、银染：凝胶揭下后置银染固定液(30%乙醇，10%乙酸)中固定4～12小时，30%乙醇洗2次，各30分钟；三蒸水漂洗3次；0.1%硝酸银染液染色30分；少许三蒸水洗涤；银染显色液(2.5%碳酸钠，0.02%甲醛)显色10分钟，直至条带清晰；终止液(1%乙酸)终止3分钟；少许三蒸水漂洗5分钟，封干保存，照像。