〔摘要〕 目的： 探讨细胞增殖与程序性细胞死亡在颞下颌关节发育中的作用。方法：利用免疫组织化学技术及原位末端标记法，对胚胎及生后一周SD 大鼠颞下颌关节不同发育时期髁状突软骨中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达及程序性细胞死亡（PCD）进行了观察。结果：胎鼠颞下颌关节髁状突软骨增殖层PCNA 阳性细胞率最高，进入浅层肥厚层PCNA 阳性细胞数减少，深层肥厚层中则未见PCNA 阳性细胞。出生后髁状突软骨PCNA 阳性细胞率均较出生前低。PCD 阳性细胞主要分布于软骨增殖层及邻近深层肥厚层的浅层肥厚层中，在关节腔开始形成时髁状突软骨表面PCD 明显。结论：细胞增殖与程序性细胞死亡密切相关，协同参与调控颞下颌关节的生长发育与塑形。
关键词 增殖细胞核抗原；程序性细胞死亡；颞下颌关节；胚胎
颞下颌关节发育期髁状突软骨是下颌骨的主要生长区之一。髁状突软骨具有类似于长骨生长板独立生长的特性，软骨细胞可不断分裂、增殖使下颌骨及颞下颌关节得以生长发育［1］。程序性细胞死亡（programmed cell death ，简称PCD）是一种细胞自然死亡现象，虽然对它在胚胎发生、器官发育及形成中的作用已有所认识［2］，但作为细胞生命活动的增殖及程序性细胞死亡在颞下颌关节发育过程中的相互关系及作用的研究尚未见报道。本文通过观察胚胎及出生后一周SD 大鼠各时期颞下颌关节发育中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ，简称PCNA）的表达及 PCD的变化，探讨细胞增殖与程序性细胞死亡在颞下颌关节发育中的意义。
1 材料与方法
1.1 动物模型及标本制备
选用纯系、三月龄 SD大鼠（上海产）20 只，按雌雄4∶1的比例同笼，每天早晨8∶00 观察雌鼠阴栓，以观察到阴栓计为妊娠0 d，分别于妊娠13、14、15、16、17、18、19、20 d脱颈处死大鼠，切取胎鼠（E）颞下颌关节部置于40 g/L 的多聚甲醛中固定后常规脱水、石蜡包埋。另取出生后（P）1、2、3、4、5、6、7 d幼鼠颞下颌关节部（沿正中线切开鼠头后分切）置入含盐酸、甲酸及冰醋酸的40 g/L 多聚甲醛液中充分固定、脱钙，流水冲洗后脱水、石蜡包埋。作颞下颌关节矢状面切片，厚度5 μm，以备HE染色、免疫组织化学染色及原位末断标记使用，切片前载玻片预先严格清洁处理并涂APES胶。
1.2 免疫组织化学检测PCNA
免疫组织化学染色采用 ABC法，石蜡切片脱蜡至水，经体积分数为φ=3% H2O2 封闭内源性过氧化物酶及枸橼酸缓冲液微波修复抗原10 min后，用正常羊血清封闭30 min；加PCNA单抗（鼠抗大鼠，美国Santa Cruz 公司产品）置于4 ℃过夜，室温下复温1 h后滴加生物素化二抗37 ℃反应30 min ；再加ABC复合物37 ℃孵育30 min，DAB 显色后，二甲苯透明、封片。
1.3 原位末断标记法（TUNEL法）标记PCD细胞
TUNEL （Tdt-mediated dUTP nick end labelling）法（试剂盒购自美国Oncor公司）：切片常规脱蜡至水，室温下20 mg/L的蛋白酶K消化15 min；然后置于含φ =3% H2O2的 PBS溶液中处理5 min，加50 μl的平衡液（TUNEL试剂盒原配）1 min；再加含TDT 酶反应液15 μl于37 ℃反应1.5 h后用预热的中止反应液中止反应（TUNEL试剂盒原配）；buffer1漂洗2 次（15 min/次）后加φ=2% 的正常羊血清孵育30 min；滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2 h；经buffer1 、buffer3漂洗后，加新配制的显色液 (NBT/BCIP显色系统，用buffer3配制，NBT 4.5 μl、BCIP 3.5 μl、左旋咪唑0.24 mg/ml) 20 μl，暗处显色。中止显色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
1.4 PCNA、PCD阳性细胞计数及统计方法
在光学显微镜下，随机选取5 个 40×10高倍视野，用10×10 网格分别计数髁状突软骨增殖层及浅层肥厚层的阳性细胞数及细胞总数，并分别计算胚胎及生后PCNA 及PCD 的平均阳性细胞百分率和标准差。
