肿瘤相关巨噬细胞在口腔癌中作用的研究进展

    口腔鳞状细胞癌（简称口腔癌）是常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发口腔癌患者超40万例；我国口腔癌每年发病约5万人，死亡超2万人。过去30年，尽管手术、放疗、化疗、生物治疗等方案不断进步，修复重建水平也不断提高，但口腔癌的预后没有明显改善；局部复发和转移是其致死的主要原因。
    近年来研究发现炎症微环境在恶性肿瘤发生及侵袭转移中发挥重要作用。口腔癌是炎症相关的鳞状上皮癌，吸烟、咀嚼槟榔、HPV感染等长期刺激导致口腔炎性微环境，炎症可致正常口腔黏膜上皮恶变为口腔癌，并促其侵袭转移。肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）是肿瘤微环境中重要的炎症和免疫效应细胞，与包括口腔癌在内的多种恶性肿瘤密切相关。研究口腔癌中TAMs的特征和功能，有助于阐明口腔癌发生发展的机制，为口腔癌的诊治及预后判断提供新的思路。
    1.口腔癌中TAMs来源及表型分化
    巨噬细胞来源于骨髓单核细胞前体，这些前体细胞从血管渗透到各个组织，并在不同组织微环境中分化为不同亚型。巨噬细胞在γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）激动剂等诱导下向经典活化途径的M1型巨噬细胞分化，参与炎症反应及肿瘤免疫过程；巨噬细胞在IL-4、IL-10等诱导下向替代活化途径的M2型巨噬细胞分化，根据刺激因子的不同M2型巨噬细胞又可分化为M2a、M2b、M2c、M2d4种亚型，发挥抑制肿瘤免疫及促肿瘤侵袭转移作用。
    由于肿瘤微环境的波动，肿瘤中TAMs各表型通常共存，受特定微环境调控。在肿瘤早期，TAMs主要为M1型，抑制血管新生，激活机体抗肿瘤免疫功能；相反，随着肿瘤的进展，受低氧环境及来自肿瘤和基质细胞的多种信号因子调控，TAMs主要分化为M2型，促进肿瘤细胞增殖及肿瘤血管生成、调节免疫抑制及胞外基质重塑等，是肿瘤侵袭转移的潜在贡献者。
    口腔癌中的TAMs来源于外周血中的单核细胞，口腔癌组织结构松散的新生血管导致单核细胞自血液中浸润聚集至癌组织中，在癌细胞、癌基质细胞和免疫细胞分泌的趋化因子和细胞因子诱导下向TAMs分化。Mori等发现口腔癌中的TAMs主要是CD163+的M2型，CD80+的M1型较少，并发现CD163+细胞数随着临床病理分期增高而增加，认为口腔癌及其微环境产生IL-4、IL-10、VEGF等细胞因子及趋化因子促进TAMs向M2型分化。不同研究组采用不同的标志物，同样发现口腔癌中TAMs以M2型为主。
    三重免疫荧光染色证实，表达不同标志物的M2型TAMs在口腔癌中分布不同：CD163+的M2型分布在癌基质和癌周围浸润区，CD204+和CD206+的M2型分布在癌细胞和癌巢内，表明口腔癌中M2亚型的分布和功能不同。
    2.TAMs在口腔癌前病损中的作用
    吸烟、咀嚼槟榔等不良习惯刺激口腔黏膜发生不典型增生、口腔白斑等癌前病变，可进展恶变为口腔癌。Lu等发现口腔黏膜不典型增生组织中CD68+TAMs数量显著少于口腔鳞癌组织。
    Chawla等研究也发现口腔黏膜不典型增生中CD68+TAMs数量少于口腔鳞癌，但显著多于正常口腔黏膜。Wang等研究发现口腔黏膜鳞状上皮增生、口腔黏膜不典型增生中IFN-γ表达而CD163不表达，而口腔癌中CD163高表达、IFN-γ低表达，提示在口腔黏膜病变发展到口腔癌之前，病变微环境中M1型TAMs占主导地位。
    在口腔白斑中，巨噬细胞在轻度、中度、重度不典型增生白斑中逐渐增多，且巨噬细胞数量与CD4+T细胞数量正相关，认为口腔白斑中形成Th1主导的微环境，并诱导浸润的巨噬细胞向M1表型分化。虽然口腔白斑中可检测到CD163+TAMs，但其共表达磷酸化的STAT-1，表明在口腔白斑微环境中，TAMs主要为M1表型。
    在口腔上皮良性增生、中重度不典型增生、原位癌等口腔癌前病损中，随着口腔上皮病变恶性程度的增加，CD163和CD204的表达趋于增加，提示M2表型TAMs的分化可能在病变恶变期间逐渐发生。在口腔白斑和口腔癌组织中，IFN-γ的表达随口腔白斑进展而逐渐降低，在口腔癌中表达最低；TAMs数量随病变进展同时增加，在口腔癌中的浸润最多，表明TAMs引起的免疫抑制作用促进了口腔癌发生。
    以上研究提示口腔癌前病变中TAMs以M1型为主，经过复杂、多步骤的过程，TAMs向M2型分化，促使口腔癌前病损向口腔癌进展。
    3.TAMs在口腔癌中的特征及功能
    3.1TAMs在口腔癌中浸润及与临床病理特征和预后的关系
    多项研究显示CD68+TAMs在口腔癌组织中浸润并与临床病理特征相关。Marcus等采用组织微阵列分析102例口腔癌/口咽癌，结果显示CD68+TAMs浸润数目显著增加，并与淋巴结转移、淋巴结外浸润、临床分期相关，特别是可作为淋巴结转移的独立标志；但CD68+TAMs细胞数量与总生存率无相关性，原因可能是纳入病例随访时间较短。
    Liu等发现CD68+TAMs浸润与口腔癌病灶大小及淋巴结转移相关，认为CD68+TAMs可促进口腔癌的侵袭，致使预后较差。Lu等免疫组化研究92例口腔癌组织标本，发现口腔鳞癌中CD68+TAMs计数与口腔癌病灶大小、淋巴结转移、临床分期和复发有关，并提出TAMs计数是口腔癌无病生存率和总生存率的预后指标。
    另两项研究同样认为口腔癌中CD68+TAMs细胞数量与淋巴结转移和总生存率相关。Fujii等免疫组化研究108例口腔癌组织，发现CD68+TAMs浸润与口腔癌TNM分期相关，但与口腔癌分化程度无相关性。
    Bagul等和Boas等同样认为口腔癌标本中CD68+TAMs浸润与口腔癌分化无相关性，可能原因为口腔癌免疫原性差，自身免疫抑制强。研究口腔癌组织中CD68+TAMs微定位时发现，癌间质组织中CD68+TAMs数量最多，多于癌巢组织和癌旁组织，并与肿瘤分级和淋巴结转移相关，10年总生存率和无病生存率降低。
    荟萃分析显示，CD68+TAMs浸润数量与不同的临床病理特征及预后相关性结果不尽相同，可能因为各研究中口腔癌部位不同、病因不同、样本数量不同、抗体滴度等实验方法不同、CD68+TAMs细胞计数标准不同、统计分析方法不同。上述研究以CD68作为TAMs的标志物，无法区分是M1型还是M2型TAMs，因此多位学者进行了进一步的研究。
    Weber等应用计算机辅助定量细胞计数分析早期口腔癌（T1-T2）组织切片发现伴淋巴结转移病例中CD68+、CD163+细胞计数显著大于无淋巴结转移病例，在伴淋巴结转移的口腔癌中CD163+细胞明显多于CD68+细胞，表明M2型TAMs与口腔癌淋巴结转移相关。
    Wang等提出CD163+M2型TAMs与淋巴结转移及总生存率相关，可作为生存预后的独立指标。Fujii等发现在临床Ⅱ期口腔癌中CD163+细胞数显著增多，而在临床Ⅲ期病例中CD163+细胞没有增多，认为口腔癌中M2型TAMs与年龄相关，推测随着年龄增加，机体免疫功能下降，作为免疫效应细胞的巨噬细胞数量减少。
    Troiano等发现CD163在头颈部鳞癌中高表达并与肿瘤不良预后相关，建议CD163可用来评估头颈鳞癌预后。Kouketsu等证实CD163与口腔癌浸润深度及颈淋巴结转移显著相关，可用作口腔癌侵袭性的标记物。体外研究发现，敲除口腔癌细胞中的CD163可抑制癌细胞生长。上述研究结果表明口腔癌中浸润的TAMs主要为M2型，并与口腔癌临床病理特征及预后密切相关。
    3.2TAMs抑制口腔癌免疫功能
    肿瘤免疫微环境主要由巨噬细胞、T淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞和髓样抑制细胞组成。在肿瘤来源趋化因子和细胞因子的影响下，TAMs丧失了提呈肿瘤相关抗原、刺激T细胞和NK细胞的肿瘤免疫功能；同时，TAMs分泌大量CCL17、IL-10等多种免疫抑制因子，抑制T细胞、NK细胞介导的免疫应答，参与肿瘤免疫逃逸。
    在头颈鳞癌中TAMs数量增加伴随树突状细胞数量减少，临床预后差，提示在口腔癌微环境中，TAMs影响了树突状细胞免疫功能。口腔癌中M2型TAMs产生的TGF-β，可以抑制Th1细胞和CTLS细胞的抗肿瘤免疫功能，同时促进免疫抑制细胞的增殖。口腔癌细胞表达的CD47可以帮助癌细胞逃避M1型TAMs吞噬作用。口腔癌病灶活检操作创伤可引起口腔癌免疫反应，导致巨噬细胞向M2型TAMs分化并发挥免疫抑制及促肿瘤的功能，增加口腔癌淋巴结转移率和远处转移率，降低5年生存。口腔癌中TAMs通过分泌IL-10调控PD-L1，促进T细胞凋亡和免疫抑制。
    3.3TAMs促口腔癌血管生成
    肿瘤微环境可以诱导TAMs分泌血管生成因子如VEGF、TNFα、MMPs等，诱导肿瘤血管生成。多项研究表明，TAMs与OSCC血管生成有关。口腔癌标本中CD68在口腔癌间质及癌细胞高表达，与肿瘤内微血管密度（MVD）和VEGF表达显著相关，表明在口腔癌中TAMs与肿瘤血管新生有关。
    Chawla等研究发现口腔癌中微血管密度的数值多于口腔不典型增生和口腔疣状癌，明显多于正常口腔黏膜。口腔癌原发灶中CD68+TAMs的数量大于颈部淋巴结转移灶，与MMP的表达成相反关系，表明原发灶中TAMs的主要作用是血管生成。进一步研究发现，口腔癌中TGF-β1可以通过TβRⅡ/Smad3信号通路促进TAMs分泌更多的VEGF。
    口腔癌中内皮糖酵解关键酶PFKFB3的表达和血管内皮细胞标志物CD31及TAMs标准物CD163的表达之间存在显著相关性，表明PFKFB3可能通过调节CD163+TAMs的浸润导致口腔癌病理性血管生成。在口腔癌细胞中清除TAMs，癌细胞凋亡增加和血管生成减少，肿瘤缩小，提示TAMs在口腔癌血管生成中起关键作用。
    3.4TAMs诱导口腔癌上皮间质转化促口腔癌侵袭转移
    上皮间质转化（epithelial tomesenchymal transition，EMT）在上皮性恶性肿瘤侵袭转移过程中的作用已被广泛认可。大量研究表明恶性肿瘤中TAMs可通过多条信号通路诱导EMT发生。将口腔癌细胞与巨噬细胞共培养，发现TAMs诱导癌细胞发生EMT，促进口腔癌侵袭；进一步研究证明TAMs分泌Gas6、磷酸化Axl，Gas6/Axl激活其下游的NF-κB信号通路促进口腔癌EMT。
    口腔癌中磷酸化Axl（pAxl）的表达和M2型TAMs的特异标志物CD206的表达高度相关；体外研究提示Axl通过PI3/Akt/NF-κB通路诱导THP-1巨噬细胞向M2型TAMs分化，M2型TAMs分泌因子IL-1β、IL-6、IL-8表达升高，VEGF和MMP-2、MMP-9表达增高。笔者所在团队亦证实TAMs通过激活NF-κB信号通路诱导口腔癌EMT。
    众多研究显示TAMs与口腔癌颈淋巴转移相关。原发灶T1、T2的口腔癌伴有淋巴结转移病例，引流区淋巴结窦腔中M2型TAMs增多，M1型TAMs减少，提示TAMs影响区域淋巴结周围环境，调配使其允许转移癌的生长。
    口腔癌中高密度的CD163+TAMs与淋巴结转移和静脉浸润显著相关；CD163+TAMs通过VEGF-C促进淋巴管生成，从而促进口腔癌颈淋巴结转移。体外研究发现将舌癌细胞株HSC-3与M2型TAMs共培养，TAMs诱导HSC-3表达EGF和TGF-β，促进癌细胞侵袭和迁徙；M2型TAMs可使HSC-3细胞NF-κBp50过量及p65缺乏，表明M2型TAMs在舌癌侵袭、转移中发挥重要作用。
    3.5TAMs在口腔癌干细胞自我更新中的作用
    癌症干细胞（cancer stem cells，CSCs）具有自我更新、无限增殖、多向分化和高成瘤性的特性，在肿瘤发生、发展、侵袭、耐药性等方面起着至关重要的作用。TAMs通过激活STAT3上调EGFR，增加SOX2基因表达，促进小鼠乳腺癌细胞中肿瘤干细胞样表型表达。
    肿瘤微环境中的基质成分也可调节TAMs协助CSCs自我更新的功能，提高肿瘤侵袭及转移的能力。检测口腔癌标本中CSCs标志物SOX2、ALDH1、CD44和TAMs标志物CD68、CD163，发现CD68表达与CD163SOX2、ALDH1相关，提示CSCs和TAMs间存在反馈环路：CSCs从血液循环中募集TAMs至肿瘤微环境中，TAMs分泌细胞因子保持CSCs的自我更新能力。
    M2表型TAMs在OSCC细胞中促进了CSCs样转变，这些CSCs样细胞高表达SOX2、CD44和CD105，细胞增殖增强，凋亡减少，细胞迁移增强，并且对化疗药物长春新碱有抗药性。
    4.TAMs在口腔癌治疗中的作用
    目前研究针对TAMs的抗肿瘤治疗主要从抑制巨噬细胞的募集、逆转巨噬细胞M2型向M1型转化、杀灭清除TAMs、结合免疫方法、单克隆抗体等几方面入手。口腔癌症中针对TAMs靶向治疗的研究较少。Feinmesser等对9例口腔癌患者术前应用天然白介素注射剂注射肿瘤周围10d；同时，静脉注射环磷酰胺以阻止T细胞抑制、口服吲哚美辛减少前列腺素对巨噬细胞诱导的免疫抑制、口服锌剂增强T细胞功能。3例肿瘤缩小（1例完全消退，2例部分消退），其余病例生存期延长，免疫治疗后CD68+巨噬细胞数量显著增加，提示免疫治疗对口腔癌有效。
    体外研究发现雷公藤内酯可抑制TAMs的IL-6、IL-8、TNF-α的分泌，E-cadherin表达上调、Vimentin和Snail蛋白表达下调，诱导口腔癌细胞凋亡，并抑制口腔癌细胞的增殖、侵袭、迁徙、血管生成。相信随着研究的深入，TAM有望成为口腔癌综合治疗的潜在药物靶标。
    5.展望
    综上所述，TAMs是口腔癌微环境的重要组成部分，在口腔癌前病损恶变、口腔癌免疫抑制、血管生成及侵袭转移等过程中发挥重要作用，促进口腔癌发生发展。深入研究TAMs与口腔癌相互作用机制，可为口腔癌治疗和预后判断提供新的方向。